蛋白分离和蛋白纯化原理和方法(一).pdf

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 蛋白分离纯化原理与方法 一 .利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有 ：1、溶液的 pH ；2、离子强度 ；3、介电常数 ；4、温度。但在同一的特定外部条件下 ，不 同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀 ：原理 ：蛋白质处于等电点时 ，其净电荷为零 ，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。 因此在其他条件相同时 ，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时 ，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥 ， 阻止了单个分子聚集成沉淀 ，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点 ，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理 ， 可以把蛋白质混合物分开。当 pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时 ，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来 ， 那些等电点高于或低于该 pH 的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象 ，能重新溶解于适当的 pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶 ：原理 ：低浓度时 ，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附 某种盐类离子后 ，带电层使蛋白质分子彼此排斥 ，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强 ，因而溶解度增高。球蛋白溶液 在透析过程中往往沉淀析出 ，这就是因为透析除去了盐类离子 ，使蛋白质分子之间的相互吸引增加 ，引起蛋白质分子的凝集 并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时 ，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时 ，例如饱和或半饱和 程度 ，很多蛋白质可以从水中沉淀出来 ，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低 ，原来 溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子 成为下一步最自由的可利用的水分子 ，因此被移去以溶剂化盐离子 ，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露 ， 由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象 ，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳 ，在水中的溶解度很高 ，而溶解度的温 度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法 ：与水互溶的有机溶剂 （甲醇、乙醇和丙酮等 ）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下 有机溶剂会引起蛋白质变性 ，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C 以下 ，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂 ，以防局部浓度 过高 ，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH 和离子强度条件下 ，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同 ，因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介电常数的 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱 ，水化程度降低 ，因此促进了蛋白质 分子的聚集和沉淀。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中 的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。 4、温度对蛋白质溶解度的影响 ：在一定温度范围内 ，约 0~40℃之间 ，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加 ，在 40~50℃以上 ，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性 ，一般在中性 pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳 定 ，因此蛋白质的分级分离操作一般都在 0℃或更低的温度下进行。 更多蛋白表达与纯化相关资料请见 ：http///topics/dan-bai-biao-da.html 二 ．根据电荷不同 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1、电泳 ：在外电场的作用下 ，带点颗粒将向着与其电性相反的电极