三种葡萄病毒RT—PCR检测及系统进化研究.docVIP

三种葡萄病毒RT—PCR检测及系统进化研究摘 要： 【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化，【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法，还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域，并开展了系统进化分析。【结果】结果表明，改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA，并以葡萄18S RNA为内参基因，RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因（Coat protein， CP）分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外，5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性，其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异，可能包括4种株系。 关键词： 葡萄卷叶伴随2型病毒； 葡萄B病毒； 葡萄A病毒； 病毒外壳蛋白基因； 病毒沉默抑制子基因 中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0197-05 葡萄是一种在全世界栽培面积大、产量高的重要果树。带毒种苗与昆虫介体的传播造成了葡萄病毒病在全世界广泛流行，严重地影响葡萄产量和品质[1-2]。葡萄可被多种RNA病毒感染并产生不同症状。葡萄卷叶伴随2型病毒（Grapevine leafroll associated virus-2， GLRaV-2）与砧木嫁接不亲和症状有关。GLRaV-2种群分为5个系统进化组，各个变异组内的分离物具有不同致病性[3]。葡萄B病毒（Grapevine Virus B， GVB）是葡萄粗皮病的主要病原物，GVB种群也包含多种变异株[4]。葡萄A病毒（Grapevine virus A， GVA）与皱木复合病有密切关系，包含了系统进化I、II、III组的变异株系[5]。 近年来，全国葡萄种植新区的建立和栽培面积的扩大，不同品种的扦插苗在各地的引进和输出也日益频繁，不科学的栽培技术，被感染种苗的扩散和带毒昆虫的传播，造了成各种葡萄病毒病在四川、山东、湖北等地的发生[6-8]。本文进一步优化了葡萄总RNA提取方法和3种葡萄病毒病RT-PCR快速检测技术，并分别克隆了GLRaV-2、GVB和GVA四川分离株的部分基因组序列。利用核酸数据库（NCBI）已知分离物核酸序列，分别开展了3种病毒的系统进化研究。开展葡萄病毒RT-PCR快速检测与病毒系统进化研究，以期为葡萄无病毒苗木生产与葡萄病毒病防控提供理论支持。 1 材料和方法 1.1 材料 在四川省欧美杂交鲜食葡萄（Vitis vinifera L.×V. labrusca L.）主产区分别采集京早晶与藤稔的1 a生成熟枝条，开展枝条韧皮部为材料提取总RNA研究。另外，藤稔（1株）、无核王子（2株）、希姆劳特（1株）、“南抗一号”（1株），用于GVA遗传多样性研究。 1.2 DAS-ELISA检测与Western blot杂交 DAS-ELISA检测试剂盒购自意大利Agritest ，参考试剂盒说明检测GLRaV-2、GVB和GVA，待测样本OD405吸收光值是阴性对照的3倍被认为是ELISA阳性，用“+”表示，阴性样本用“-”表示。参照Sambrook方法[9]，分别对京早晶与藤稔进行Western blot检测GLRaV-2、GVB和GVA（Sadarelli博士馈赠特异病毒抗血清）。 1.3 总RNA提取与RT-PCR检测 根据核酸数据库（NCBI）已知GLRaV-2基因组核酸序列（NC007448，DQ286725和AY881628），GVB基因组核酸序列（NC003602）和GVA基因组核酸序列（DQ855084，DQ855082和DQ855088），利用软件（DNAMAN 5.2.2）分别设计用于3种病毒部分基因组区域扩增的上、下游简并引物 取大约200 mg的京早晶（1号）与藤稔（2号）的1 a生成熟枝条韧皮部，分别采用3种方法提取总RNA，即热酚法[10]、LiCl法[11]，改进的硅胶颗粒吸收法[12]。其中“硅胶颗粒吸收法”，在加入硅胶前的步骤与文献[12]相同。改进部分为： 室温硅胶颗粒吸附总核酸60 min，不间断振荡5次。7 000 r·min-1室温离心 1 min，洗涤缓冲液洗涤沉淀后溶于50 μL的DEPC处理水中。DNA酶处理总核酸后，Tris饱和酚与等体积的氯仿/异戊醇抽提得总RNA。13 000 r·min-1 4 ℃离心10 min，取上清加入等体积的异丙醇。室温静置10 min，13 000 r·min-1