体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠实验探究.docVIP

体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠实验探究【摘要】 目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠疗效。方法：选择50只成年雄性大鼠，随机分五组，每组10只，分别为对照组、模型组、治疗组A（0.02 μl/g），组B（0.04 μl/g），组C（0.08 μl/g）。除对照组外，其余四组按脊髓匀浆与弗氏完全佐剂混合为抗原致敏DA大鼠EAE动物模型造模。骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为少突胶质细胞，按不同剂量注射治疗，模型组注射生理盐水。移植后，大鼠培养1、4周后每组观察BBB评分和电生理传导功能。结果：与对照组比较，模型组BBB评分降低，差异有统计学意义（P0.05）。与模型组比较，治疗组各组BBB评分有提高，差异有统计学意义（P0.05）。与模型组电生理评分（SSEPsN1、MEPs N1波峰潜时、SSEPsN1、MEPs N1波幅）比较，3个治疗组SSEPsN1、MEPs N1波峰潜时下降，SSEPsN1、MEPs N1波幅升高，差异有统计学意义（P0.05），并体现出剂量依赖性。结论：体外诱导骨髓间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠效果较好，为临床研究提供科学依据。 【关键词】 骨髓间充质干细胞； 脱髓鞘大鼠； 移植治疗 随着社会现代化的发展，脱髓鞘疾病的发病率逐年增加。髓鞘脱去后的治疗是亟待解决的难题，目前，细胞移植治疗脱髓鞘性疾病是研究的热点。研究表明，骨髓间充质干细胞不但具有自我更新和增殖的能力，而且可经诱导向神经细胞方向分化[1]。因此，本实验建立大鼠脱髓鞘模型，体外诱导骨髓间充质干细胞进行分化移植治疗，观察不同剂量的少突胶质细胞移植对脱髓鞘性疾病的改善及对脊髓神经功能恢复的影响，现报道如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物 选择50只成年雄性大鼠，随机分五组，每组10只，分别为对照组、模型组、治疗组A（0.02 μl/g），组B（0.04 μl/g），组C（0.08 μl/g）。 1.2 仪器与试剂 SIGMA2-16型水平离心机（Sigma公司），CO2培养箱（Heraeus公司），多通道电生理检测仪（澳大利亚Powerlab），青霉素-链霉素、胎牛血清（美国Gibco）。 1.3 模型建立 大鼠脊髓匀浆与弗氏完全佐剂（CFA）混合作为抗原佐剂乳化物。大鼠麻醉后仰卧，开腹，开胸，剪断下腔静脉，用止血钳固定心脏，将左心室剪开，灌注管插进主动脉，以冰生理盐水心脏灌注，至右心房流出清亮液，取大鼠脊髓，挑去脊膜及血管，称重，加等量的CFA，用注射器反复抽打制成油包水状态，即抗原佐剂乳化物。治疗组大鼠尾根部皮肤消毒，进行皮下注射抗原佐剂乳化物0.2 ml，对照组动物注射等量CFA+生理盐水。 1.4 少突胶质细胞诱导分化 大鼠处死取股骨、胫骨，置DHanks液中，暴露髓腔，用DMEM培养液冲洗至骨髓腔变白，将冲洗液收集于培养瓶中。加入bFGF、胰岛素样生长因子、EGF诱导[2]。在含DMEM培养液5 ml、体积分数为0.1的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素中，37℃、CO2下培养，每3天换1次培养液，待贴壁细胞90%融合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，然后加等量培养液终止消化，转移至无菌离心管中离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用培养液重悬细胞，按1：2传代。选第4代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，离心加入诱导液转移至含有盖玻片的培养皿中，细胞数为1×104个/cm2，放入CO2箱中培养48 h后，诱导祖细胞更换培养液，用分化培养液培养3 d。将在含10 μmol/L BrdU的少突胶质细胞培养基中生长72 h，终止培养，并用0.01 mol/L PBS清洗生长面数次。加入0.25%胰酶溶液消化细胞数分钟，加入少突胶质细胞培养基中止胰酶消化。用培养基吹打细胞制成悬液，调整细胞浓度至1.0×105 cells/μl备用[3-4]。 1.5 移植治疗 治疗组A、B、C大鼠给予少突胶质细胞移植治疗，少突胶质细胞移植前1天至实验结束每日给予环孢素A（10 mg/kg）注射[5]。以大鼠脊髓损伤区域为中心，上下2 mm范围内在2～4个点处注射[6]。吸取少突胶质细胞悬液注射到治疗组A（0.02 μl/g），组B（0.04 μl/g），组C（0.08 μl/g），模型组给予生理盐水。 1.6 大鼠后肢运动功能检测 本实验采用BBB运动功能评分对少突胶质细胞移植后大鼠后肢运动功能的恢复进行比较。后肢全瘫为0分，完全正常为21分[7]。评分时将受试动物置于平面场地上，连续观察4 min，根据BBB评分法评价大鼠后肢运动功能，评分时间为移植治疗后第1、4周进行。 1.7 大鼠脊髓神经电生理功能检测 脱髓鞘疾病通常造成