犬小孢子菌膜白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆.pdfVIP

犬小孢子菌膜蛋白PQ．LRP基因全长cDNA的克隆 硕士生姓名：庞娟 指导教师：杨国玲教授 指导小组：杨国玲教授 张振颖医师 专业名称：皮肤病与性病学 摘要 目的：犬小孢子菌病是由亲动物性真菌犬小孢子菌感染人类头皮、头发、平 滑皮肤的传染性皮肤病。近年随着宠物饲养的增加，其发病率呈上升趋势。本课 题组前期通过抑制消减杂交技术(SSH)成功构建了犬小孢子菌差异基因文库，通 过比较儿童头皮诱导培养和儿童光滑皮肤生长状态下的犬小孢子菌基因表达的差 异性，从中筛选出与头皮诱导培养相关的4条差异表达基因，并对获得的目标基 因进行测序及实时荧光PCR进行定量，其中膜蛋白PQ．LRP(PQlooprepeat protein)基因在头皮组织诱导培养下较光滑皮肤具有高表达，这是否与犬小孢子菌 易于侵犯儿童头皮组织有关引起我们的关注。目前国内外学者热衷于对犬小孢子 菌的蛋白酶的研究，对膜蛋白的研究较少。故本课题组拟依据差异显示得到的 全长cDNA序列，并初步分析其结构与功能，为后期探讨此基因在头癣发病机制 中的作用提供理论基础及新型药物的开发提供设计靶位。 方法：采用经形态学鉴定及对其核糖体保守区基因序列测序鉴定的犬小孢子 cDNA 菌菌株为实验株，提取总I矾A，按照SMARTer．刑RACE Kit Amplification primer,GSPl)和 用PRIMER5．0软件设计3／5’端基因特异性引物(genespecific GSP2；巢式PCR引物(nested genespecific NUP进行第二轮PCR反应。对第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行切胶回 收，纯化，克隆到pMDl8．T载体，经双酶切鉴定为阳性克隆者，进行测序(北京 华大基因)，对测序结果使用DNAStar软件进行序列拼接，得到膜蛋白PQ．LRP基 因全长cDNA序列。 结果： 1．犬小孢子茵头癣株A518，在沙堡固体及液体培养基中均生长良好，形成 茵丝团块。 2．根据犬小孢子菌PQ．LRP基因片段设计Y-RACE基因特异性引物及巢式 PCR引物，从3’端扩增出一条长度为789bp的序列。 3．根据犬小孢子菌PQ．LRP基因片段设计5-RACE基因特异性引物及巢式 PCR引物，从5’端扩增出一条长度为181bp的序列。 4．将获得的3’末端与5’末端序列与已知序列拼接后得到1522bp的eDNA序 结论： 1．所获得序列是一个全长的基因序列，具有完整的开放阅读框架； 2．相似性对比：该序列与马发癣菌7次跨膜蛋白1及断发毛癣菌PQ．LRP同 源性均达到81％，与红色毛癣菌PQ．LRP同源性为79％。 eDNA快速末端扩增法 关键词：犬小孢子茵膜蛋白PQ．LRP 2 cDNA of canis Acquiringfull--lengthMicrosporum membrane proteinPQ—LRPgene Master Juan degreecandidate：Pang Supervisor：Pr