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1、PCR 原理概述 2、Real Time PCR 化学原理 3、Real Time PCR 数学原理 4、Real Time PCR 数据分析 5、Real Time PCR 技术应用 PCR是如何实现的? 传统PCR具有以下基本要素dsDNA（DNA模版）, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（缓冲液）, Taq polymerase（DNA聚合酶）等 PCR是如何实现的? 在控温模块（Temperature Block）上实现循环反应 Denaturating of template（模板变性） Annealing of oligos（引物退火） Extension of primers to make new products （序列延伸） PCR是如何实现的? 所需的片断会逐渐增多 PCR的数学基础 Xn = X0 ( 1 + Ex )n n = PCR循环数 Ex = PCR扩增效率 X0 = 起始目标DNA分子数 Xn = 第n个循环后的目标DNA分子数 理想情况下，Ex = 100%，Xn = X0 · 2n PCR的三个阶段 指数/对数扩增期 Xn = X0 · 2n（理想状态） Ex不变 线性扩增期 Ex逐渐变小 平台期 Ex = 0 什么是Real Time PCR? 实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Real Time PCR是如何实现的? 在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence） Real Time PCR是如何实现的? 随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增加而增加 Real Time PCR是如何实现的? Real Time PCR仪包括Thermal Block控温模块, Light Resource 激发光源, Light Splitter分光系统, 和 CCD Camera信号采集四大部分 Real Time PCR是如何实现的? Real-time PCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化 Real Time PCR是如何实现的? 最后，Real Time软件会对采集到的数据进行分析 Real Time PCR化学原理 荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？ TaqMan? 化学原理 (又称 5’-Nuclease ) TaqMan? 化学原理 TaqMan? 中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物 TaqMan? 化学原理 TaqMan? 中第三段短片段序列称为探针，结合到序列中间 TaqMan? 化学原理 探针标记两种 染料分子 TaqMan? 化学原理 完整的探针 TaqMan? 化学原理 完整的探针 TaqMan? 化学原理 如果探针断裂了…… TaqMan? 放映开始 TaqMan? 化学原理 Denaturating of template（模板变性） TaqMan? 化学原理 Annealing of oligos（引物退火） TaqMan? 化学原理 Taq酶 登场…… TaqMan? 化学原理 找到引物序列…… TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Extension of primers（序列延伸） TaqMan? 化学原理 Taq酶 很特别…… TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解