脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血的探究.pdfVIP

㈣Ⅵ 血 血 齐 内 田 A万包 厶口 尿 献 下肢缺 ^日 ．^=’ ㈠…【～．，研 究 皮祖 鼠 错摘 要 目的：糖尿病并发症是威胁人类健康的世界性公共卫生问题。糖 尿病血管并发症发病率高，其中周围血管病变所致下肢缺血可致足溃 疡，甚至截肢，是糖尿病致残的重要因素，给病人及家属带来极大的 痛苦及负担。糖尿病下肢缺血发病机制复杂，目前认为主要原因是动 脉粥样硬化同时伴侧支循环受损，其中侧支血管能力形成受损占重要 地位。近年来的大量研究表明内皮祖细胞(EPC)在血管形成中起重 要作用。正常情况下循环EPC的相对数量较少，而在创伤或缺血时显 著增加。但糖尿病患者EPC增殖能力远低于非糖尿病患者，且与活化 内皮细胞的粘附、增殖以及形成小血管的能力下降，缺血组织对外源 性生长因子反应性也降低。脐血中存在内皮祖细胞，其数目高于同等 量外周血，取材无创伤，易找到HLA相合的供者，可长期保存。使用 脐血内皮祖细胞治疗糖尿病血管病变是一个值得研究的领域，但目前 国内外尚缺乏此方面的实验研究。故本研究采用链脲佐菌素(STz) 建立糖尿病模型，结扎大鼠双后肢股动脉形成下肢缺血，应用射线照 射减轻大鼠排斥反应，抽取足月产妇脐血，分离脐血单核细胞，培养 细胞7天，获得内皮祖细胞，经尾静脉注射或者局部肌肉注射，将内 皮祖细胞移植入大鼠。荧光示踪内皮祖细胞，观察大鼠双后肢溃疡变 化情况，通过对腓肠肌中Ⅷ因子与VEGF表达的研究，探讨脐血内皮 祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的效果及方法。方法：1、脐血内皮祖细 胞的分离、培养及鉴定：取产妇足月产脐血50“，运用密度梯度离 心法分离获得单核细胞，利用内皮祖细胞贴壁的生长特性，培养细胞 7天，贴壁生长细胞即含内皮祖细胞。将培养细胞消化，‘用细胞表达 数活细胞数，达到移植有效活细胞数。2、糖尿病大鼠模型的建立及 分组：将20只体重约200250 g的健康雄性Wistar大鼠常规喂养一周 后，随机选取15只给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)55毗 复制糖尿病模型，5只正常大鼠给予柠檬酸缓冲液等容量注射作为正 常对照组。上述大鼠分为四组：①糖尿病股动脉结扎后经尾静脉注射 EPC治疗组(Diabetes+ligation+intravenous 糖尿病大鼠射线照射后结扎双后肢股动脉，复制缺血模型，再经尾静 脉注射EPC，观察经尾静脉注射EPC治疗后下肢缺血的疗效。②糖尿 intramuscular 动脉，右后肢局部注射EPC，观察缺血局部肌肉注射EPC治疗后下肢 缺血的疗效。左后肢局部注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)作为糖尿 controlwithout 糖尿病未处理组：糖尿病不结扎不注射EPC(Diabetes EPC and injectionligation，DC)。④正常大鼠股动脉结扎后经尾静脉 EPC移植治疗组(Normal+ligation+intravenous 常血糖大鼠射线照射后结扎双后肢股动脉，尾静脉注射EPC。3、各 组大鼠进行如下实验：①荧光示踪内皮祖细胞：用GFP(绿色荧光) 在内皮祖细胞注射前转染内皮祖细胞，转染成功后移植入大鼠，一周 后取腓肠肌组织作冰冻切片，观察有无荧光表达并对比荧光强度，示 踪内皮祖细胞是否到达缺血部位。②腓肠肌HE染色与Ⅷ因子免疫组 化染色观察毛细血管数：注射内皮祖细胞后21天，处死大鼠，无菌操 作取腓肠肌，固定，脱水，石蜡包埋，行HE染色和Ⅷ因子的免疫组 化染色，通过观察肌纤维间毛细血管数情况了解内皮祖细胞治疗后侧 支循环有无改善，内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的疗效。(要)RT-PCR 检测双后肢腓肠肌VEGFmRNA表达：注射内皮祖细胞后21天，处死 大鼠，无菌操作取腓肠肌，行RT-PCR检测VEGFmRNA表达，从基因 水平研究内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血的疗效。4、统计学处理： 析及SNK-q检验，DL