《生物工程课程综合实验》.docVIP

徐 州 工 程 学 院 教 案 2012 年至 2013 年 第 2 学期 第 17 周 星期 实验一 生物工程菌株开发策略与菌株的分子鉴定 一、实验目的实验原理 (a)酶的粗提； (b)酶的精制。 (9) 微生物产酶菌种的保藏 (二)生物工程菌株研究开发的策略 采用遗传工程的方法开发新型基因。 克隆表达基因，获得蛋白产物。 1、高活性产酶菌株的筛选分离 （1）功能性菌株筛选步骤。 （2）高活性产酶菌株的筛选方法 2、目标酶基因克隆分析 （1）根据保守性序列设计引物方法。 （2）使用PCR方法扩酶基因，测序，分析序列特征。 3、目标酶基因重组表达分析 要求：（1）重组菌构建。 （2）重组菌诱导表达的方法。 （3）柱层析分离目标酶蛋白的方法。 （4）目标酶蛋白活性特征和应用价值分析。 （三）菌株分子鉴定的方法 三、实验材料 异丙醇乙醇氯仿DNA marker、NaClTaq DNA聚合酶、dNTP mixture引物1ml、2ml、5ml塑料离心管，烧杯，移液器。1、分离菌株 根据所需要酶的特性，从特定的环境中筛选分离产酶菌株。 2、培养基1L的LB(Luria-Bertani)培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g。1L的筛选培养基：羧甲基纤维素10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 10 g，葡萄糖2 g，琼脂12 g。 菌株基因组DNA的提取(1) 按1%的接种量接种到装有5ml LB培养基的试管中，30℃150rpm振荡培养过夜，使其长至对数期。次日取1ml菌液于1.5ml 离心管10,000×g离心1min沉淀菌液。 (2) 弃上清加1ml 0.9% NaCl将沉淀重悬浮10,000×g离心3min。 (3) 弃上清加450μl TE缓冲液（12 mM Tris-HCl12mM EDTA， pH8.0）重悬浮加50μl 20% SDS轻轻的上下颠倒离心管使之混匀75℃水浴5min(直至菌液裂解变为澄清)。 (4) 加500μl 3:1的酚：氯仿抽提蛋白质，轻轻上下颠倒使之混匀，10,000×g离心5min。 (5) 轻轻吸取上清于一新的1.5ml离心管(注意不要吸到中间的蛋白质) 并补足体积到500μl加500μl 3:1的酚:氯仿10,000×g离心5分钟。吸上清如此反复直至看不到中间的蛋白质层为止(注意尽量防止DNA在抽提中发生断裂降解)。(6) 吸取上清于一新的1.5ml离心管并补足体积到500μl加500μl氯仿轻轻混匀10,000×g离心5min。 (7) 吸取上清于一新的1.5ml离心管，加1/10体积3M NaAc，然后加等体积的异丙醇，上下颠倒几次，此时应看到有絮状沉淀产生，10,000×g离心5min。 (8) 将上清吸出，加1ml 70%的乙醇清洗沉淀，10,000×g离心5min，去上清，室温干燥。 (9) 加50μl TE缓冲液溶解沉淀，取2μl电泳检测DNA质量及浓度。或用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，使用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。 菌株的16S rDNA序列引物序列为：F: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，R:5’ GGTTACCTTGTTACGACTT3’ PCR程序是：① 94℃预变性5min；② 94℃变性30s，③ 57℃退火60s，④72℃延伸90s，进行22次循环扩增；⑤72℃延伸10min。在 “上海生工生物工程技术服务有限公司”将16S rDNA测序。在NCBI网站登录获得的序列，获得accession number。 菌株利用GeneBank基因库中的信息，分析菌株的分类学地位。使用DNAMAN程序建立演化树。 S rDNA序列实验目的实验原理三、实验材料 LB液体培养基（1L），Na2HPO4，NaH2PO4，大肠杆菌，1ml、2ml、5ml塑料离心管，烧杯，器，超声波破碎仪。 Lysis buffer(含1mg/ml溶菌酶)，在冰水中放置30min，随后放-80℃速冻完全。 (2) 将速冻后的溶液放冰水中缓慢融化，待融化完全后，使用超声波破碎（功率300W，2s/次，工作60次，每次间隔15s）。 (3) 4℃10,000×g离心20min，弃沉淀，将上清加到Ni-NTA柱上，使带有His标签的重组蛋白结合到柱子上。 (4) 向结合蛋白的Ni-NTA柱加入4ml Wash buffer，清洗柱子，重复此步骤一次。 (5) 加入2ml Elution buffer 将结合的重组蛋白从柱子上洗脱下来。将洗脱下来的蛋白放入浓缩管中浓缩(7,400×g，10mi