产葡萄糖氧化酶的筛选.docVIP

※生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 01 149 产葡萄糖氧化酶菌株的筛选及 发酵培养基的优化 摘 要：从土壤中筛选出了一株产葡萄糖氧化酶较高的菌株，利用响应面法对该菌株的产酶培养基进行优化以提高产酶量。响应面法优化的发酵培养基组成为：葡萄糖109.41g/L、复合氮源(m(月示蛋白胨):m((NH4)2SO4)=3:1)37.36g/L、 吐温-80 37.15g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L 和KCl 0.5g/L。采用该优化培养基所得葡萄糖氧化酶的活力为1.54U/mL，较优化前提高了31.6%。 关键词：葡萄糖氧化酶；酶活力；培养基优化； 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD)系统名为β-D- 葡萄糖氧化还原酶(EC1.1.3.4)。它能专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢[1]。葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用[2]。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖[3-4]；可脱掉食品中的氧，以达到改善食品品质、延长食品货架期的目的；作为面粉改良剂溴酸钾的替代品，用作一种更为安全的面粉改良剂[ 5 ]。在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物为葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体在微生物中主要是黑曲霉和青霉属菌株。目前我国生产的工业酶制剂纯度普遍较低，长期以来依赖进口，因此寻找进口酶制剂的替代产品具有重要意义。响应面法可同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价[6]，因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，该法已经广泛应用于各类培养基以及发酵条件的优化[7-9]。为了提高微生物产酶量，罗斌等[10]利用响应面法优化了乳酸杆菌产γ- 氨基丁酸的培养条件，提高了目的产物的生产量；Aghaie 等[11]利用响应面法优化了黑曲霉产有机酸的发酵条件，经过发酵条件的优化提高了有机酸的产量。本实验从土壤中进行高产葡萄糖氧化酶菌株的筛选，在此基础上利用响应面法对发酵培养基进行优化，以提高葡萄糖氧化酶的产量。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 土壤样品的采集 采样地点：福州文武雪峰农场；采样部位和深度：取样深度为0～10cm；采样季节为秋季；采样方法、数量：采用多点混合土样采集方法，每个混合土样由20 个样点组成，每个点的取土深度及质量均匀 一致，每个混合样品取0 . 1 k g ，对采集样品进行编号待用。 1.1.2 培养基 平板分离培养基：底层培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、 MgSO4·7H2O 0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂20g/L；上层培养基：葡萄糖8 0 g /L、可溶性淀粉1 0g /L、KI1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，pH5.6。种子培养基：NaNO3 2g/L、K2HPO41g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4 0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂20g/L。发酵培养基：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.7g/L、KCl 0.5g/L。 1.2 方法 1.2.1 高产葡萄糖氧化酶菌株的初筛根据Fiedure 显色法[12]，称取10g 采集来的土壤样品于经过灭菌(121℃、20min)处理的装有100mL 生理盐水且含有玻璃珠的250mL 锥形瓶中振荡30min。然后用 无菌水稀释成10-4、10-5 两个稀释度，分别用移液器吸取0.1mL涂布于预先配制并且灭菌的分离培养基中，28℃培养3d 后置于5℃冰箱中静置2d，然后在室温下存放至出现蓝色颜色圈。选取颜色圈中的菌株接种到种子培养基的斜面上培养。 1.2.2 高产葡萄糖氧化酶菌株的复筛 将初筛得到的斜面转接种于含有发酵培养基的摇瓶中继续培养5 d ，测定发酵液的酶活力。 1.2.3 粗酶液制备 将上述筛选出来的菌株接种于(孢子浓度104 个/mL)发酵培养基中，于3 0 ℃恒温摇床培养5 d ，摇床转速30 0r/min。发酵完毕后纱布过滤，菌丝体经研磨，磷酸钾缓冲溶液(50mmol/L，pH6.5)浸酶，得粗酶液。 1.2.4 酶活力的测定 葡萄糖氧化酶的酶活力测定采用郭晓贤等[ 1 3 ]的方法。取250mL 三角瓶，加入2% 葡萄糖磷酸缓冲液( pH5.6) 25mL 及1mL 粗酶液，立即于29℃振荡lh，然后加入0.1mol/L NaOH 溶液 20mL 以终止反应，用0.1mol/L盐酸滴定剩余的NaOH，记录所消耗的盐酸体