小鼠白细胞介17A原核表达系统的构建.pdfVIP

ⅧIlllrllfllIlllrl iiiiIIIliIIIIIllflllIII|lIIIFl+if llll 小鼠白细胞介素17A原核表达系统的构}J1 研究生： 姜 川I 专 业： 神经病学 导 师： 曹秉振教授 中文摘要 目的 白细胞介素l 7，IL．1 7(interleukin一17)是近年来新发现的炎性细胞因子， 具有多种生物学活性，是某些疾病发生和发展的重要因素之一，受到了人们 的广泛关注。IL一17是一种主要由T细胞产生，通过表达与许多细胞上的受 体发挥作用的蛋白质。人IL．1 7是一种同源二聚多肽，主要由活化CD4+‘记忆 T细胞分泌产生。小鼠1L．17的总长度为l58个氨基酸残基，其中21个氨基 酸残基组成其前导信号序列。人IL．17与小鼠IL．17在氨基酸残基序列上有 7 62．5％的相似性，与大鼠IL．17有58％的相似性。国内外的实验证实，IL．1 sclerosis，MS) 在多种神经系统疾病中都有高表达。多发性硬化(multiple 患者体内IL．17表达水平增高，并且与疾病的严重程度有_定联系。IL．17A 是IL．17家族中最主要的成员，参与免疫介导的炎症损伤，在全身炎症反应 中发挥重要作用。如果能够制备出针对IL．17A的特异性抗体，并且在实验 中证实此特异性抗体可以表现出突出的治疗效果，那么不但对于临床治疗多 发性硬化提供一个新的治疗方向，更可能实现其在神经系统疾病中的广泛应 用。 方法 lL．1 7A的引物，从提取的小鼠基因组中，利用PCR方法采用高保真DNA聚 1 合酶使小鼠IL．17A基因片段大量复制扩增，片段长度为63 bp，扩增片段为 平滑末端，再与脱氧三磷酸腺苷相连接，将连接后的基因片段再与T克隆载 重组质粒，利用重组质粒对大肠埃希氏菌DH5a感受态细胞进行转化，并对 经氨苄青霉素和指示培养基上蓝白斑筛选的阳性重组质粒分别进行PCR检 测、双酶切检测和测序检测。双酶切检测结果较为理想的重组质粒，同时双 酶切消化表达载体pET32a(+)，将纯化后的目的片段相连接，得到重组表达 l IPTG，200rpm诱导目的蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)@表达。 结果 经SDS PAGE凝胶电泳和Western免疫印记检测后，有融合蛋白表达， IL．1 7A融合蛋白大部分以可溶形式在大肠埃希氏菌BL2 l(DE3)中表达。 结论 7A能够在大肠埃希氏菌 实验结果证实，重组质粒pET32a(+)／d,鼠IL．1 BL2 l(DE3)中表达出目的蛋白，所获得的蛋白大小与预期相同。 IL．1 关键词 7；多发性硬化；原核表达；蛋白表达 2 PROKARYOTICEXPRES SION’SSYSTEM OFINTERLEUKIN．1 7A