造血发育相关因子对小鼠AGM区血液血管干细胞的调节影响.pdfVIP

中 文 摘 要 血液血管干细胞（hemangioblast ）是一种具有双向分化潜能的干细胞，在体内 外发育的过程中，能够分化成为造血细胞和内皮细胞。血液血管干细理论已经通 过在胚胎干细胞分化模型中得到验证，即胚胎干细胞经2.5-3.5 天分化为拟胚体， 再在特殊的分化体系中可以形成一种特殊的Blast 样集落，其具有同时分化产生内 皮细胞和造血细胞的能力，这种形成Blast 样集落的细胞被称为BL-CFC （the blast colony-forming cell ）。近年来，血液血管干细胞在起源、分子生物学特点、体外诱 导分化等方面的研究取得了较大进展。既往研究发现小鼠胚胎定向造血的起源部 位AGM 区亦存在类似血液血管干细胞的前体HPP-HA 。之后在小鼠胚胎AGM 区 同样发现了 BL-CFC 的存在，建立了特殊的的血液血管干细胞模型，此模型已被 应用于研究小鼠 AGM 区血液血管干细胞的发育和调控，如经典的造血生长因子 IL-3 也可以促进血液血管干细胞的发育和分化。然而，鉴于血清培养体系营养成 分复杂，不利于精细研究某些细胞因子对血液血管干细胞的真实作用。因此，本 研究在小鼠胚胎AGM 区已建立的BL-CFC 模型的基础上，建立了一个BL-CFC 的 无血清孵育培养模型，优化了常规的 BL-CFC 培养体系，并在此基础上，研究造 血发育相关因子对小鼠AGM 区血液血管干细胞的调节作用。 本研究首先在小鼠胚胎 AGM 区建立了BL-CFC 的无血清孵育培养模型。取 E10.5 小鼠胚胎AGM 区，消化成单细胞，在无血清培养体系下孵育12h 后进行半 固体集落培养。在bFGF 、SCF、VEGF 、IL-6、IGF-I 和LIF 细胞生长因子的共同 作用下培养3-3.5 天后，可见一种特殊形态的集落开始出现，其形态和分化特征与 E9.5-12.5 小鼠胚胎AGM 区来源的Blast 集落相似。然后进行BL-CFC 造血及内皮 分化功能鉴定。集落培养 4-5 天后，挑取单个集落进行造血集落培养。所有的 BL-CFC 可产生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix 等一种或多种造血集落。贴壁细胞换 EGM2 内皮细胞完全培养基继续进行诱导，第7-10 天时可见贴壁细胞中有大量鹅 卵石样内皮细胞以及少量成熟的造血细胞。随后进行体外成血管功能检测，结果 表明：贴壁细胞高比例的吞噬 LDL ；体外Matrigel 上可形成血管样结构，呈网络 状生长。同时，将BL-CFC 在OP9 基质细胞上进行造血和内皮细胞分化功能检测。 挑取单个Blast 集落，接种于OP9 基质细胞上培养7-10 天后，所有集落在OP9 上 4 均显示造血细胞的分化潜能（CD45 阳性），30%的HA 在OP9 上可以形成CD31 阳性的管样结构。 接下来，研究了三种与造血发育相关的细胞因子 IL-3、SCF 和NGF 对小鼠胚 胎AGM 区细胞的调节作用。将上述3 种细胞因子与AGM 区细胞分别在SR 及FBS 体系下体外共孵育 12 小时后进行BL-CFC 接种，结果显示IL-3 在两种体系下均能 扩增BL-CFC ，而NGF 在两种体系下对BL-CFC 均无作用，SCF 只在SR 体系中对 BL-CFC 有明显的扩增作用。 综上，本研究在小鼠胚胎AGM 区建立了BL-CFC 的无血清孵育培养模型，优 化了常规的BL-CFC 培养体系，基于上述模型，深入探讨了造血发育相关因子IL-3 、 SCF 和NGF 在血清及无血清两种孵育培养模式下对小鼠胚胎AGM 区细胞的调节作 用，与血清体系相比，无血清体系更能灵敏、准确的反映细胞因子对血液血管干细 胞的作用，从而体现了无血清培养模型的优势。 关键词：血液血管干细胞，BL-CFC ，AGM 区，造血发育 5 Developmental Hematopoiesis Related Cytokines: the Regulatory Effects on Hemangioblast in Mouse AGM Region