PCR及RT-PCT基础问题分析.docVIP

PCR及RT-PCR之基础问题解答 作者：佚名 来源：生物秀 时间：2007-9-4 1.??问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： 1）RNA被降解 建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 3）多糖同RNA共沉淀 建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 建议解决方法： 确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟。 对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体. 确定GSP是反义序列。 5）起始RNA量不够 建议解决方法： 增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 6）RNA模板二级结构太多 建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对ThermoScript可以到65。 注意：不要在＞60时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65。 注意：不要在高于37时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 7）引物或模板对残余的RNA模板敏感 建议解决方法： 在PCR前用RNaseH处理。 8）靶序列在分析的组织中不表达 建议解决方法： 尝试其他靶序列或组织 9）PCR没有起作用 建议解决方法： 对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。 2.问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： 1）PCR引物设计较差 建议解决方法： 避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 2）DNA含有抑制剂 建议解决方法： 诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。 3）富含GC的模板 建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 4）模板浓度太低 建议解决方法： 使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 5）镁离子浓度太低 建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 6＝退火温度太高 建议解决方法： 使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。7＝引物浓度太低 建议解决方法： 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。 3.问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因： 1＝物和模板非特异性退火 建议解决方法： 在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。 试用允许高温cDNA合成的GSP。 2＝GSP设计较差 建议解决方法： 遵循用于扩增引物设计的同样原则 3＝RNA中沾染了基因组DNA 建议解决方法： 使用扩增级DNase处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因： 1＝形成引物二聚体 建议解决方法： 设计在3端没有互补序列的引物。 2＝引物和模板非特异性退火 建议解决方法： 以2到5间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。