赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究.docVIP

ZL-9601赖氨酸生产菌某些特性及发酵试验的研究 2006-1-5 14:52:38? ? 新闻来源：农业生物技术学报 李秀锦　 仲 　飞　 刘绍军 　常学东 　孙树杰 　赵彦波 　冀振华 (河北农业技术师范学院，昌黎 066600) 　　摘　要：　本研究对ZL-9601赖氨酸生产菌菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料，初步确定了该菌的产酸能力。结果表明，该菌为短杆菌(0.8～1.0×1.0～2.5　μm), 需氧, 发酵最适温度30, 最适pH7.0～7.2, 最适碳源为葡萄糖, 最适氮源为硫酸铵; 该菌不分解赖氨酸, 可耐15%的赖氨酸, 耐30%的葡萄糖。以糖蜜为主要原料, 在最适温度和pH的条件下, 产酸可达6%以上。　　关键词: ZL-9601菌种；赖氨酸；发酵； 菌种特征 　　赖氨酸是人和多种动物的必需氨基酸。在谷类食品和饲料中添加适量赖氨酸可提高这类食品或饲料中蛋白质的营养价值。目前, 在国内外市场上, 赖氨酸的需求量日益增加, 培育赖氨酸高产菌株和研究最佳发酵工艺条件便受到人们的普遍重视［1～4 ］, 许多高产菌株陆续被选育出来［5～8］。如国内选育的TL-1菌株产酸量为4.5% 。为进一步提高赖氨酸的产量, 人们又在这些菌种的基础上通过各种选育过程得到更高产的菌株［9］。如ZL-9601赖氨酸生产菌株就是由谷氨酸棒杆菌AS1.563通过进一步诱变处理选育出的高产菌株。本研究主要就ZL-9601菌株的形态、培养特性和生理生化特性进行了初步鉴定和分析，并以糖蜜为主要原料进行发酵试验, 旨在为实际生产确定最佳发酵条件提供科学依据。 1　材料与方法 1.1　菌种 　　ZL9601菌株由河北农业技术师范学院食品生化实验室选育。该菌为谷氨酸棒杆菌AS 1.563 (中科院微生物所提供)的诱变株，遗传标记为AECr, Hom-。1.2　主要培养基1.2.1　斜面种子培养基　牛肉膏1.1%, 蛋白胨1.0%, 葡萄糖0.5%, NaCl 0.5%, 琼脂0.2%, pH7.0, 在0.14mpa压力下灭菌20min, 后置于37 培养箱培养24h, 备用。1.2.2　发酵种子培养基　糖蜜2.0%, 豆饼水解液0.5%, (NH4)2SO4 0.4%, CaCO 0.5%, K2HPO4 0.1%, MgSO4 0.04%, pH7.0, 于250mL三角瓶内装25mL种子培养基, 在0.14mpa压力下灭菌20　min。1.2.3　发酵培养基　糖蜜20%, 豆饼水解液1.0%, 玉米浆0.6%, (NH4)2 SO4 2%, K2HPO4 0.1%, MgSO4 0.05%, FeSO4 20mg, MnSO4 20mg, pH7.0, 于250mL三角瓶装液25mL发酵液, 在0.14mpa压力灭菌20min, 冷却后接种。1.3　培养条件 　　将经斜面培养活化的菌种接种于发酵种子培养基中，置于往复摇床上振荡培养24h(30)为种子培养物;按110(64×107/mL菌体)的接种量将种子培养物接种于发酵培养基中, 在30±10, pH7.0～7.2条件下, 在往复式摇床(振幅5～8　cm, 频率120次/min) 发酵72h。1.4　其它特殊培养基　　淀粉水解培养基, 吲哚试验培养基, 甲基红试验培养基, M-R试验培养基, V-P试验培养基, 芽孢培养基, 高丝氨酸营养缺陷型培养基等。1.5　试验及测定方法　　菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查主要参照《工业微生物试验技术手册》的方法［10］。　　发酵液赖氨酸的测定采用茚三酮比色法［11］, 并加以改进。其主要操作过程：吸取发酵液4mL, 离心(6000r/min, 10min)去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂(A液：茚三酮1.25g溶于94　mL乙二醇甲醚中; B液：CuCl2*2H2O 1.97g溶于32mL 0.1mol/L柠檬酸溶液中; 将A、B两液混合, 用蒸馏水定容到250mL) 4mL, 混合, 在沸水浴加热20min, 冷却后在生化自动分析仪测定475　nm处的吸光度值, 通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。1.6　主要仪器　　560-生化分析仪(上海第三分析仪器厂), SHA-C水浴恒温振动器(江苏常州国华仪器厂), 高压蒸汽灭菌锅, 显微镜, 超净工作台等。 2　结果与分析 2.1　菌体形态特征观察　　由表1可以看出, 该菌为格兰氏阳性杆菌。 短杆状或球形, 无鞭毛, 不形成芽孢。 斜面菌种细胞较小, 当被培养到一级种子培养基时, 菌体体积变大, 但在二级种子培养基和发酵培养基时(开始产酸), 菌体又渐渐变小、变圆。2.2　细菌的培养