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进化基因组学——期末论文DNA测序技术的发展历史The development history of DNA sequencing technology姓名：xxx专业：微生物学学号：120150008322015年12月31 DNA测序技术的发展历史摘要：基因组测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年S a nger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代，第三代测序技术技术正在向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。关键词：DNA 测序技术发展历史DNA 测序技术是分子生物学研究中最常用的技术, 它的出现极大地推动了生物学的发展。成熟的 DNA 测序技术始于 20世纪 70年代中期。 1977年M axam和G ilbert[ 1]报道了通过化学降解测定DNA 序列的方法。同一时期, Sanger[2]发明了双脱氧链终止法。20世纪 90年代初出现的荧光自动测序技术将 DNA 测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代 DNA 测序技术。最近几年发展起来的第二代 DNA 测序技术则使得 DNA测序进入了高通量、低成本的时代。基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现, 该技术测定 DNA 序列更快, 并进一步降低测序成本。DNA 测序技术的发展经历了几个重要阶段：①经典的手工测序，主要依赖于一些生物化方法和电泳分离技术，包括 Sanger 测序和 DNA 化学降解测序；②第一代测序技术，主要基于 Sanger 法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化；③第二代测序平台，又称为新一代测序技术，主要包括 Solexa 测序、Solid 平台、454测序、HeliScope 遗传分析系统等，它们的测序原理不完全相同，但共同的特点是都不需要传统的克隆步骤，实现了更高的通量。目前，该技术仍在发生着迅速的变化，它的发展使人们对遗传物质 DNA 的认识层次不断升华，从对单一、局部的基因或基因片段的研究转变成了对整个基因组的研究[3]。1 第一代测序技术第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用, 如人类基因组计划( humangenom e projec,t HGP)主要基于第一代 DNA测序技术。目前基于荧光标记和 Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们基础上发展起来的各种基因组测序技术统称为第一代基因组测序技术。总的包括化学降解法，双脱氧链终止法，荧光自动测序技，杂交测序技术。1.1化学降解法美国哈佛的Alan?Maxam和Walter?Gilbert领导的研究小组也几乎同时发明出DNA序列测定方法—Maxam-Gillbert?DNA化学降解法测序[1]。其基本原理是用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。该法设计四组特异的反应：①G反应，用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，导致多核苷酸链可在该处断裂；②G+A反应，用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂；③T+C反应，用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基；④C反应，在有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。这样一来，同一个末端标记的DNA片段在四组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基，生成四组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点，每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离此后组产物，再从放射自显影片上即可读出序列[4]。1．2双脱氧链终止法双脱氧链终止法又称为 Sanger法[ 2], 该方法的原理是: 核酸模板在 DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸 ( dNTP, 其中的一种用放射性 P32标记 )存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入 4种双脱氧核苷三磷酸 ( ddNTP), 因为双脱氧核苷没有 3c-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的末端, 该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3c端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段 3c端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。Sanger法