Primer_5基本使用.docVIP

Primer 5.0使用方法 Primer Premier 5.0软件用途 Primer Premier是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件，利用它的高级引物搜索引物数据库，巢式引物设计，引物编辑和分析等功能，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。其主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析，DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。 Primer 5.0Primer 引物设计 Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件，包含了强大的自动搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物。Primer Premier也提供了人工控制搜索引擎的方法便于根据您的特殊要求制定标准输出的引物，通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和二级结构关键参数，如Tm值GC含量和自由能G，还能以图形显示。 为设计用于定点突变的引物，该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的引物编辑工具，您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物。 您可以分析所有想用到的引物，可以选择事先搜索的引物，或手动添加引物软件。 Manual Search 手动搜索及引物设计原理如下： 在过去十年中，为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展，我们对引物稳定性二级结 构和适宜长度的了解，使得我们在保证引物特异性的前体下，大大提高了引物的扩增效率而Primer Premier 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡。 引物长度 引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度，对多数实验适宜引物长度为18到24个碱基，等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建。 library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用，长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物，也允许您通过降退火温度来能提高反应的灵敏度，不过长引物通常更易于形成包括发卡结构，二聚体自身互补等二级结构。理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。 为设计一条高效引物有几个参数必须考虑Primer Premier搜索所考虑的参数依次如下： Tm 融链温度 Primer Premier根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链温度。根据已发表的实验数据文献8 ，PCR反应的合适Tm范围为56到63°C，以上机制是被设计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物。 GC% GC含量 对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适，而对于测序引物和杂交探针来说GC 含量至少应为50%。 Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性。应尽量避免3 末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。 3’ End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端，如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带，而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。 GC Clamp GC钳 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端，这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合，选择有合适稳定性的引物，能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。 Repeats and Runs 重复和循环 Primer Premier自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物，例如引物包含ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量。 Secondary Structures 二级结构 二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素，二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率形成发卡环的引物，则不能在PCR扩增中发挥作用。 Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应，仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性，可以使用Primer Premier软件中的Hairpin Report功能帮助您回避类似二级结构Dimer 二聚体。 引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结 构，它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物。二聚体可以在序列相同的两条引物或