细胞培养攻略.docxVIP

一、细胞培养基础和步骤细胞培养基大全：/experiment/430/488/490/491/140812.htm细胞原代培养步骤：/experiment/451.htm细胞传代培养步骤：/experiment/505.htm更多细胞培养实验：/experiment/allExperiment.htm二、细胞培养常见问答1、加到培养基中的血清 必须灭活吗？?答：不是必须的，看做什么实验了。?2、四季青胎牛血清灭活是56 ℃30分钟吗？?答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子 。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56 ℃，30 min。?3、我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？?答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。4、我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体 ，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体 补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67 收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？?答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。5、(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶 液，用的是D-PBS，有关系吗？?答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子 、氨基酸 等成分带来的负面影响。?我在实验室处理血清的时候，有一次水浴 箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80 ℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56 ℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37 ℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。?我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45 ℃到62 ℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。?你可以摸索一下，血清从-20 ℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。?(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？?答：正常。?6、如何选用培养基？?培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：??7、为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。? ?8、L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？? ?L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－