新型金属螯合亲和反胶团对EGFP萃取特性的的分析研究.pdfVIP

摘要 反胶团萃取技术广泛应用在蛋白质等生物活性物质的分离过程中，但是传统 的离子型反胶团在萃取过程中往往对蛋白质选择性低以及使蛋白质失活。基于 此，本研究室前人开发出了新型的金属螯合亲和反胶I爱I(MCARM)，为了验证此 反胶团对实际表达蛋白的萃取分离能力，本文利用MCARM对基因工程表达产 物6xhis标记的增强型绿色荧光蛋I兰t(EGFP)的萃取特性进行了系统的分析。 首先，本文研究了MCARM对纯化好的EGFP的萃取以及反萃特性。研究 内容包括EGFP的萃取及反萃动力学：金属离子浓度、pH、盐浓度对EGFP萃 取率的影响；咪唑浓度、pH和盐浓度对EGFP反萃率的影响。结果表明，MCARM 萃取EGFP的平衡时间为6min，反萃平衡时间为120min。当镍离子浓度为2 mmol／L，萃取的操作pH为7~9，盐浓度为0．1mol／L时，可将浓度为0．5 mg／mL 的EGFP的萃取率达到90％以上。当反萃液中咪唑浓度为500 mmoi／L，pH在8～10 之间，盐浓度为0．1mol／L时，EGFP的反萃率达到90％以上，所得产物具有荧 光活性。验证了MCARM对EGFP具有高萃取率和高反萃率。 在上述工作基础上，本文进一步利用该反胶团直接从表达菌的破菌上清液中 纯化可溶表达的EGFP。从上样蛋白质浓度、反胶团中镍离子浓度以及萃取次数 等方面对EGFP的纯化条件进行了优化，并最终与金属螯合色谱进行了比较。结 果表明，料液蛋白浓度为0．6 mL，反胶团中镍离子浓度为3 mg／mL，上样量为4 mmol／L时，破菌上清液的一次总萃取率为70．6％，二次萃取后的总萃取率可提 高至87．1％，得到的产品纯度为86．9％，纯化因子4．03，实现了直接从表达菌产 物中高度分离纯化EGFP的目标，与金属螯合色谱相比，MCARM的处理量较大、 萃取分离所用的时间较少，体现出新型MCARM的实际应用前景。 关键词：增强型绿色荧光蛋白；萃取；反萃；金属螯合亲和反胶团；纯化 ABSTRACT for Reversedmicellesthe extractionhavebeen studied．Ionic protein extensively were toformthereversed the surfactants mostly micelles，butproblems employed were denaturationof intheextraction andlow to the protein process selectivity onthese novelmetal reversed proteins．Basedproblems，a chelatingaffinity-based havebeen inour orderto the micelles(MCARJVOdevelopedlaboratory．Instudy ofMCARMintheextractionof separationcapacity expressedproteins，we X theextraction