PIG11基因逆转录病毒载体构建和其高表达对HepG2细胞凋亡影响.pdfVIP

前 言 PIG11 基因也称为TP53I11 （tumor protein p53 inducible protein 11 ），是一个 p53 下游靶基因。1997 年Polyak 等 [1]在研究人结肠癌细胞经历p53 依赖的凋亡 机制中，应用基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE ）技术， 首先鉴定p53 的高表达明显诱导PIGs （p53-induced genes ）的表达，并且命名为 PIG1-13 。PIG11 基因就是其中之一。 目前研究已知，p53 是重要的肿瘤抑制基因，它的突变或活性缺失能影响到 [2-6] 肿瘤的发生 。p53 作用的发挥主要是通过激活或抑制大量下游基因表达来完成 [7-11] [12-15] 的 。这些p53 下游基因及其相互作用蛋白组成一个巨大的信息网 ，调控 细胞应答DNA 损伤等刺激，或者与其它蛋白相互作用作为激活子、抑制子及辅 助因子等。而 p53 最重要的功能之一是促进细胞凋亡。新发现的 PIG11 基因是 p53 下游基因，那么，PIG11 基因对细胞的凋亡是否也有影响呢？ Zhu JH等[16] 的研究显示，PIG11在p53诱导的凋亡过程中发挥作用。Ricketts SL等人[17] 用微细胞介导的染色体转移技术（microcell mediated chromosome transfer ）发现人第11号染色体11p11.2-p12存在肝脏肿瘤抑制基因。对人肝细胞 癌细胞系的研究发现，PIG11基因在HepG2和Hep3B 中的转录明显减少甚至消失， 因此，PIG11基因可能是人类肝细胞癌的抑癌基因。通过大量临床样本收集也证 实了肝癌组织及肝癌细胞株中PIG11蛋白表达显著低于正常肝细胞[18] 。而在加入 某些处理因素如药物后，可使PIG11表达增强，促进p53诱导的细胞凋亡[19-21] 。 Chiba T等在研究组蛋白脱乙酰基酶（HDAC ）抑制剂古曲抑菌素A （TSA ）诱导 肝细胞HuH7, Hep3B, HepG2凋亡中，运用cDNA微阵列分析发现8个基因明显被 [22] 诱导，其中之一为PIG11 ，这也表明PIG11基因表达与肝细胞癌凋亡密切相关 。 因此，将PIG11基因导入肝癌细胞中并对其进行研究很有意义。 我们先前的研究首次证实了PIG11 基因编码的蛋白是一种胞浆蛋白，其高表 达参与了 As2O3 诱导细胞凋亡的过程，并能通过升高细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS ）水平而增强细胞对As2O3 介导凋亡的敏感性[23,24] 。同时， 采用基因工程技术成功构建含PIG11cDNA 的真核表达质粒及制备PIG11 多克隆 抗体，为下一步对PIG11 基因的研究打下了良好的基础。 PIG11 基因作为新发现的肿瘤抑制物 p53 蛋白诱导的一系列下游基因PIGs 9 之一，其编码产物在p53 介导的细胞信号传导过程中的作用还不清楚。因此，本 实验构建了PIG11 高表达HepG2 细胞株，并以此细胞模型为基础探讨PIG11 基 因高表达对HepG2 细胞凋亡的影响。通过一系列相关实验，证明PIG11 基因确 实能促进细胞凋亡。 10 实 验 材 料 1.1 菌株与质粒 E.coli DH5α由本所保存。质粒pcDNA3.1/NT-GFP-PIG11 由梁晓秋博士构建。 逆转录病毒载体质粒pLXSN 由南华大学生理教研室唐小卿博士惠赠。 1.2 细胞 PA317 细胞、NIH3T3 细胞由武汉中国典型培养物保藏中心引进；