逆境胁迫对植物生理生化指标与影响1.docVIP

1.1 供应材料。小麦种子；主要试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] ，PBS, （pH=5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。 1.21 Pro 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受等胁迫时体内的脯氨酸含量增加，它在一定程度上反映植物受环境胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，它在一定程度上也反映了植物受环境干旱胁迫的情况。 1.23 抗氧化酶 植物体内存在着一套负责清除活性氧所产生的抗氧化系统，在植物正常生长情况下，它使活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，在逆境诸如干旱胁迫下，这种平衡被打破。这种变化可通过分光光度器测定。 1.24 GSH 还原型的GSH是植物细胞中重要的抗氧化剂之一，其可通过膜蛋白巯基与二硫键化合物结合的比例，对细胞膜起保护作用。其含量的变化，一定程度上反映了植物受干旱胁迫的情况。 1.25 H2O2 过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。 1.3 实验方法 1.31 Pro的提取。分别取0.1 g实验组（为干旱处理5天）和对照组（不做干旱处理）的胚芽鞘置于研钵中，加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨，再用2 mL 3% SSA洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：取上清液各2 mL ，分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂再煮沸15 min，冷却后，5000 rpm离心10 min ，分别测定A520 。 1.32 MDA提取。分别取0.1 g实验组和对照组（与1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂充分研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置与离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：分别取上清液各2 mL ，加入0.6%TBA（用0.6% TCA配制） 2 mL，煮沸12 min，冷却后，5000 rpm离心10 min ，分别测定OD450和OD532。 1.33 抗氧化酶的提取。分别取0.1 g实验组和对照组（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂，充分研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：POD测定；取POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液（提取液）100 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470 。PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液（提取液）0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410 。 1.34 GSH的提取。分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨，用2 mL 5% TCA洗研钵置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液定容至5 mL。测定：上清液各1 mL ， 分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7) 和0.5 mL 4 mM DTNB (用0.1M