3种结肠癌细胞株中DLC1基因表达及其启动子区甲基化状态研.docVIP

3种结肠癌细胞株中DLC1基因表达及其启动子区甲基化状态研 　 【摘要】 目的: 研究 候选抑癌基因DLC1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，初步探讨结肠癌细胞株DLC1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。 方法 ：采用RTPCR技术分别检测DLC1基因在人结肠癌细胞株CaCo2、HT29和LoVo中的表达水平； 应用 甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态；分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC1基因启动子区域高甲基化状态细胞后，再检测DLC1基因mRNA表达水平。结果：人结肠癌细胞株CaCo2和LoVo中DLC1 mRNA呈阳性表达，HT29中的表达呈阴性表达；CaCo2和LoVo细胞DLC1基因启动子区域未发生甲基化，而HT29出现启动子区高甲基化状态；经5氮杂胞苷药物干预后，HT29结肠癌细胞的DLC1基因表达明显增强。结论：结肠癌细胞株HT29中DLC1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。 【关键词】 DLC1基因 甲基化 结肠癌细胞株 甲基化特异性PCR 毕业论文 DLC1（frequently deleted in liver，DLC1）基因，位于人类染色体8p2122，可能是一个新的抑癌基因。1998年Yuan等[1]首先用代表性差异 分析 技术（representational difference analysis，RDA）将其从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因的改变是肝癌的早期发生事件之一。随之，DLC1基因的功能及其在乳腺癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等恶性肿瘤中发病机制的研究陆续展开。Yuan等[23]研究认为，肝癌和胃癌中DLC1基因启动子区域高甲基化可导致该基因表达沉默。 Wilson等[4]报道DLC1基因在结肠癌细胞株HT29、HCT116中表达沉默，但其相关机理尚不明了。为揭示DLC1基因在结肠癌中表达沉默的可能机制，作者研究了候选抑癌基因DLC1在3种结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态，旨在探讨结肠癌细胞株DLC1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。 1材料与方法 论文代写 1.1 材料 毕业论文 选取CaCo2、HT29和LoVo 3种人结肠癌细胞株（均购自 中国 科学 院上海细胞生物研究所）。细胞株用含10％的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素的RPMI 1640培养液，在5％CO2、37℃、湿饱和的条件下培养。培养细胞呈对数生长期时用于实验。 论文代写 1.2 细胞总RNA提取 用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，以OligodT(18)为引物进行逆转录合成cDNA模板。以DLC1基因特异性引物进行PCR扩增，引物分别位于第1和第5外显子[5]，以βactin为内参照（引物序列见表1）。反应条件均为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共4２个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。 毕业论文 1.3基因组DNA的制备及亚硫酸氢盐修饰 用饱和酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。沉淀用70％乙醇洗涤，干燥后溶于TE缓冲液中，用紫外分光光度计定量。取1～3 μg基因组DNA，3 mol·L-1 NaOH使DNA充分变性。向已变性的DNA中加入新配制的3 mol·L-1亚硫酸氢钠(pH 5.0)和对苯二酚，充分混合，离心后加上200 μl石蜡油封层，50℃保温10～16 h。用Wizard DNA Cleanup System纯化DNA。 论文代写 1.4 甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR,MSP）检测 亚硫酸氢盐修饰DNA经两对引物扩增，分别为甲基化与非甲基化引物扩增（引物序列见表１），扩增片段为DLC1基因启动子区且包含6个CpG位点[6]。反应条件均为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，按表1温度退火30 s，72℃延伸40 s，共45个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物于1.7％的琼脂糖凝胶电泳观察。 1.5 亚硫酸氢盐基因测序（sodium bisulfite genomic sequencing） 论文代写 亚硫酸氢盐修饰 CaCo2、LoVo和HT29细胞株DNA经PCR扩增DLC1基因启动子区CpG位点（引物序列见表１）。PCR反应条件与MSP相似，退火温度按表1，对扩增产物进行测序。 毕业论