6实验六TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反应素.ppt

实验六 TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反应素 医学检验系 临床微生物免疫检验教研室 何应中 一、目的及要求 掌握：凝集法的基本原理和TPPA检测梅毒螺旋体抗体的 实验原理。 熟悉：TRUST检测反应素的原理，TPPA的操作方法和结 果判定。 了解：TRUST的操作及结果判断，TPPA和TRUST的注意事 项及临床意义。 二、基本概念 1.直接凝集反应：细菌、螺旋体、红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象。 2.间接凝集反应：先将可溶性抗原(或抗体)吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体(或抗原)反应，在适当电解质参与下，出现特异性凝集现象。 基本概念 凝集反应是一种定性检测方法，根据凝集现象出现与否判定结果是否阳性或阴性，但也可做半定量检测，即将待测样本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现凝集反应的最高稀释度为效价。 基本概念 梅毒螺旋体(treponema pallidum,TP)引起全身性慢性传染病--梅毒，主要通过性交传染。TP进入人体后，可产生两种抗体，一种是非特异性抗心拟脂抗体(又称反应素)，可用牛心拟脂检测，称非梅毒螺旋体抗原血清反应；另一种是抗梅毒螺旋体抗体，可用梅毒螺旋体检测出来，称梅毒螺旋体抗原血清反应。 本次实验以梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验(treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体和梅毒甲苯胺红不加热血清试验(syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST)检测血清中的反应素。 三、梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验 (treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体 （一）实验原理 TPPA是将梅毒Treponema Pallidum(Nicho1s株)的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上。这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体(TP)抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应(Particle Agglutination Test；PA法)，由此可以检测出血清或血浆中的梅毒螺旋体(TP)抗体，并且可用来测定抗体效价。 （二）试剂和器材 1. 梅毒螺旋体抗体诊断试剂(凝集法) 包括溶解液、血清稀释液、致敏明胶粒子(冻干粉)、未致敏粒子(冻干粉)、阳性对照血清等，有商品供应。 2. 待测血清 临床筛选获得。 3. 器材 U型微量反应板、可调移液器(10～100μl, 100～1000μl)、加样吸嘴、刻度滴管、25μl微量滴管、平板混合器、判定用观察板等。 （三）操作方法 1．1％致敏粒子和1％未致敏粒子的配制：分别加入一定量的溶解液溶解混匀即可。请在使用前30分钟于室温(15～30℃)下进行配制。 2．用移液器加入血清稀释液100μl于U型微量反应板第1孔中，从第2孔至第6孔各加入25μl。 操作方法 3．用移液器取样本25μl至第1孔中混匀，然后用移液器从第1孔吸取25μl于第2孔中混匀，再从第2孔中吸取25μl于第3孔中……依次类推，以2N的方式从第1孔稀释至第6孔。 4．用试剂盒中提供的滴管或移液器在第3孔中滴入1滴(25μl)未致敏粒子，从第4孔至第6孔各加入1滴(25μl)致敏粒子。 操作方法 5．用平板混合器(或用手轻轻撞击敲动)以不会导致微量反应板孔内容物溅出的强度混合30秒钟，加盖后于室温(15～30℃)下水平静置2小时后或次日，在观察镜上记录并观察其反应图像，或者利用免疫稀释判定装置进行测定。见表3。 操作方法 表3 凝集法操作步骤 Well No. 1 2 3 4 5 6 血清稀释液(ul) 100 25 25 25 25 25 待测血清(ul) 25 25 25 25 25 25 25 未致敏粒子(ul) 25 致敏粒子(ul) 25 25 25 最终稀释倍数 1:40 1:80 1:160 1:320 混匀，加盖后置室温(15～