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DNAPKcs短发夹RNA载体构建及其表达 　 作者：田晓予，邢辉，翁丹慧，陈刚，卢云萍，马丁 【摘要】 　　目的 构建DNAPKcsshRNA表达载体，观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的 影响 。 方法 将针对人DNAPKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞，RTPCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率，MTT法测定DNAPKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA 测序 分析 证实DNA－PKcs shRNA表达载体pSIRENDNAPKcs shRNA构建成功并在细胞中表达，转染重组载体的A2780细胞DNA－PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降；重组载体转染细胞增殖活性明显降低。 结论 成功构建DNA－PKcs shRNA表达载体为进一步 研究 DNA损伤修复基因DNA－PKcs奠定了基础；DNA－PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。 【关键词】 DNAPKcs基因；短发夹RNA；真核表达载体；细胞增殖活性 　 The Construction of DNAPkcs Shorthairpin siRNA Recombinant Vector and Its Expression in Vitro 毕业论文 Key words：DNAPKcs; shRNA; Eukaryotic expression vector; Proliferation activity 　　DNAPKcs蛋白是DNA蛋白依赖激酶（DNAdependent ProtEin Kinase,DNAPK）的催化亚基，在人类的DNA双链断裂(DSBs)的主要修复途径NEHJ(nonhomologous endjoining)中发挥重要作用。本课题选择DNAPKcs编码区基因序列，与真核表达载体pSIREN构建DNAPKcs的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,在细胞内发挥RNA干扰作用，在转录后水平特异性封闭DNAPKcs基因的表达，观察该基因的抑制对卵巢癌A2780细胞增殖的影响，并为进一步研究该基因生物作用奠定实验室基础。 毕业论文 1 材料与方法 论文代写 1.1 材料 1.1.1 细胞及主要试剂 毕业论文 卵巢癌A2780细胞株（武汉大学医学保障中心）， 胎牛血清（杭州四季青公司），1640培养液（Gibco BRL公司）,质粒 pSIRENDNRDsRedExpress（BD Clontech公司）, DH5α（清华天为 时代 ），质粒小提试剂盒（北京博达泰克公司），凝胶回收试剂盒和质粒大提试剂盒（Qiagen公司）， Lipfectinamine2000脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司）， PCR反应试剂盒（Fermentas公司），Trizol试剂（Invirtogen公司），各种工具酶（Takara公司），DNAPKcs单克隆抗体（Neomarker公司），碱性磷酸酶抗鼠IgG（晶美公司），BCIP/NBT显色试剂盒（武汉凌飞 科技 有限公司），MTT（Sigma公司）， PCR引物及shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成，DNAPKcs shRNA表达载体的测序由大连亚法生物技术公司完成。 论文代写 1.1.2 主要仪器 CO2培养箱（Hereaus公司）， PCR仪和蛋白垂直电泳系统（美国BioRad公司），酶标仪（美国Biotek公司产）。 1.2 方法 1.2.1 DNAPKcs 特异性shRNA转绿模板设计 选择人类DNAPKcs（Genebank U47077 ）cDNA两个部位作为目标序列，根据 目前 通用的siRNA设计原则， 应用 hppt:／／ 提供的“siRNA target finder and design tool” 设计DNAPKcs 特异的19mt寡核苷酸序列加入9bp的loop环结构、U6启动子终止序列及两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，全长67bp ，以形成发卡状siRNA(shRNA)转录模板,正义链1：5GATCCCATGGCAGGAGAGAATCAGTTCAAGAGACTGATTCTCTCCTGCCATGTTTTTTGGAAG3’反义链1：5AATTCTTCCAAAAAACATGGCAGGAGAGAATCAGTCTCTTGAACTGATTCTCTCCTCCATGG3’正义链2: 5GATCCCTTTATGGTGGCCATGGAGCAAGAGACTCCATGG