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PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染探究 　 作者：胥文春，曹炬，许颂霄，罗进勇，朱旦，尹一兵 【摘要】 目的：获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法：分离培养肺炎链球菌TIGR4，获取其染色体DNA，采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET32(a)内，酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定，镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物，观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果：DNA序列与GenBank中的数据相符，所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA，其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论：重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染，该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一. 【关键词】 肺炎链球菌 　　0引言 　　肺炎链球菌是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病原菌，疫苗侯选蛋白主要集中在其表面的毒力因子如肺炎链球菌表面蛋白A（PspA）和胆碱结合蛋白A（CbpA）等［1-2］. PspA是最早确定的肺炎链球菌毒力因子之一，它可以与乳铁蛋白结合而使乳铁蛋白丧失功能并抑制补体活化，降低C3b在肺炎链球菌表面的沉淀从而干扰补体介导的调理吞噬作用，在肺炎链球菌引起的侵袭性感染中起着重要作用［3-4］. 我们用基因重组技术表达纯化肺炎链球菌毒力因子蛋白PspA，并探讨其刺激产生的抗体对肺炎链球菌侵袭性感染的抵抗作用. 　　1材料和方法 　　1.1材料血清4型肺炎链球菌TIGR4购自美国国家菌种保藏中心（ATCC）. 大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)，质粒PET32(a)为本室保存. 质粒PMD18T载体、限制性内切酶EcoR I，Kpn I，PrimeStar DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Takara（大连）公司. DNA提取试剂盒为上海华舜公司产品. IPTG，DAB，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)购于Sigma公司. His Tag McAb，His Bind Column(NiNTA)柱及HRP标记羊抗鼠IgG为Novagen公司产品. Balb/c小鼠，雌性，6~8周龄，质量18~20 g，购于重庆医科大学实验动物中心. 　　1.2方法 　　1.2.1PETPspA表达载体的构建将肺炎链球菌TIGR4在C+Y培养基中增菌到对数生长中后期，提取基因组DNA，以之为模板扩增PspA片段(1329 bp). 上游引物：5′GGGGTACCATGATTTTAACAAGTC TAGCCAG3′，含Kpn I位点；下游引物：5′CGGAATTCTTATTCTTCTTCATCTCCATC3′，含EcoR I位点，由上海生工生物技术公司合成. 胶回收PCR产物并与PMD18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR、酶切及测序鉴定. 将测序正确的克隆载体和PET32(a)表达载体分别用EcoR I，Kpn I双酶切，胶回收目的片段，T4 DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，双酶切及PCR鉴定. 重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)，于氨苄青霉素平板上筛选. 　　1.2.2PETPspA重组载体的诱导表达将阳性克隆过夜培养，按1∶20接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，250 r/min振摇培养，A600 nm=0.6~1.0时加IPTG（终浓度为1 mmol/L）诱导，37℃振摇1~4 h，离心收集诱导菌，SDSPAGE分析目的蛋白表达情况. 　　1.2.3表达产物的纯化及鉴定低温离心收获诱导菌，冰上超声破菌，12 000 g低温离心1 h，收集上清液，同时以相同体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，行SDSPAGE以明确蛋白是在上清液还是在包涵体. 将上清液用0.45 μm滤膜过滤后转入镍层析柱内，用含不同浓度咪唑的缓冲液梯度洗脱，测定各洗脱管的A280 nm，SDSPAGE监测各阶段目的蛋白情况. 收集洗脱蛋白并以PBS透析除盐，Bradford法蛋白定量，冷冻真空干燥，-20℃保存. 　　 　　取诱导的全菌裂解物，经SDSPAGE后用电转仪转膜，以His Tag McAb（1∶1000稀释）为一抗，羊抗鼠HRPIgG（1∶3000稀释）为二抗，DAB为显色底物做Western Blot检测. 　　1.2.4免疫动物将小鼠随机分为2组，每组12只. 腹腔免疫小鼠，实验组方案为：①基础免疫：PspA 10 μg／只+CFA，②加强免疫：每隔2 wk加强1次(PspA 10 μg／只+IFA)，连