MS—275体外诱导膀胱癌细胞凋亡机制分析及探析.docVIP

MS—275体外诱导膀胱癌细胞凋亡机制分析及探析 　　[摘要] 目的 研究组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂MS-275对膀胱癌T24细胞的诱导凋亡作用，并初步探讨其分子机制。 方法 用MTT法检测MS-275对T24细胞的生长抑制作用，并观察其有效作用浓度，采用荧光显微镜及原位末端标记（TUNEL）法观察和检测MS-275对T24细胞的诱导凋亡作用，采用流式细胞仪（FCM）检测Bcl-2和Bax在细胞内表达的动态变化。 结果 MS-275抑制T24细胞的半抑制浓度（IC50）为（5.21plusmn;0.61）mu;mol/L。4.0 mu;mol/L的MS-275处理T24细胞后可观察到典型的凋亡形态学变化，且随着作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，同时引起Bcl-2及Bax的表达率分别下调和上调。 结论 HDAC抑制剂具有体外诱导膀胱癌细胞凋亡的作用，其作用机制涉及Bcl-2及Bax表达的动态改变。　　[关键词] 膀胱癌；组蛋白去乙酰化酶；细胞凋亡 　　[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0033-03　　膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年有350 000例以上的新发病例，并且有145 000人死于此病[1]。其生物学行为呈多样性，而容易复发是其重要生物学特性。目前对其发生、复发、浸润及转移的机制尚未完全明了，大部分膀胱癌在确诊时是表浅性的，经过局部手术治疗后复发率为50%～70%，进展率为15%～30%。现有的传统抗肿瘤药物治疗尚有一定的局限性，从新的角度寻求有效的抗肿瘤药物有望取得突破性进展。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deactylase inhibitors，HDAC抑制剂）是一类通过抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）而改变染色质结构，在转录水平进行基因表达调控的化合物，依其化学结构可分为六类，而MS-275是苯酰胺类HDAC抑制剂中最具活性的一种化合物，其显示出对一些血液系统肿瘤[2]和实体肿瘤[3]有较强的抗肿瘤活性。本实验将探讨MS-275对膀胱癌细胞的诱导凋亡作用及其机制。 　　1 材料与方法　　1.1 细胞培养 　　人膀胱癌T24细胞来源于中国科学院上海生物细胞研究所，实验时取对数生长期的细胞，在含10%小牛血清的细胞培养基（DMEM）培养液中培养，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。　　1.2 MTT实验 　　T24细胞以5times;104/mL、100 mu;L/孔，接种于96孔培养板，培养24 h后，分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mu;mol/L的MS-275作为5个实验组，阴性对照组不加MS-275，空白对照组为单纯DMEM培养液，每组各设5个复孔。继续培养48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 mu;L，再培养4 h，吸出孔内培养液，每孔加100 mu;L 二甲基亚砜（DMSO），酶标仪测定吸光度，选择492 nm波长，用空白对照组调零，计算细胞生长抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）times;100%。以细胞生长抑制率与药物浓度的对数作图，在图上求出MS-275对T24细胞的半抑制浓度（IC50）值。选取接近于IC50值的浓度用于下一步实验。 　　1.3 荧光显微镜观察凋亡的形态学变化　　将T24细胞以1times;105/孔接种于6孔培养板，观察细胞贴壁且生长良好后，加入浓度为4.0 mu;mol/L的MS-275作为实验组，非药物处理组作为对照组，继续分别培养12、24、48 h，细胞经胰蛋白酶消化收集后，以磷酸盐缓冲液（PBS）调整细胞密度为1times;106/mL，制成单细胞悬液，取95 mu;L细胞悬液，加人100 mu;g/ml的吖啶橙染液5 mu;L混匀，取10 mu;L混合液于载玻片上，加盖玻片后于荧光显微镜（Olympus BX60）下（515 nm激发光）观察细胞形态学变化并摄片。 毕业论文 　　1.4 原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡　　4 mu;mol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h，设阴性对照，每个时间点设3个复孔，培养结束后收集细胞悬液，做细胞涂片，行TUNEL法处理及染色，并以二氨基联苯胺显色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，分析细胞凋亡率。 　　1.5 流式细胞仪（FCM）检测细胞内Bcl-2和Bax的变化　　4 mu;mol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h，收集后4%多聚甲醛固定，PBS液漂洗2次，加入1.5 mL破膜剂透化15 min后，离心去上清，重悬于150 mu;L破膜剂中，分别加入