N-乙酰半胱氨酸对镉致人胚肾细胞凋亡拮抗作用.docVIP

N?乙酰半胱氨酸对镉致人胚肾细胞凋亡拮抗作用 　【摘要】; 目的 探讨N?乙酰半胱氨酸(N?acetyl cysteine,NAC)对氯化镉所致人胚肾(human embryonic kidney,HEK)细胞凋亡的拮抗作用。方法 应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测不同CdCl2浓度(0，10，20，40，80μmol/L)处理以及不同浓度NAC(1，2，4，8mmol/L)和镉联合作用对HEK细胞相对存活率和凋亡率的影响。结果 单纯染镉时，与对照组(0μmol/L)比较，20，40，80μmol/L CdCl23组HEK细胞相对存活率明显降低(Plt;0.01)，HEK细胞凋亡率明显升高(Plt;0.01)；NAC与镉联合作用时，与40μmol/L CdCl2比较，40μmol/L CdCl2+4，8mmol/L NAC2组HEK细胞相对存活率明显提高，40μmol/L CdCl2+2，4，8mmol/L NAC3组HEK细胞凋亡率明显降低。结论 一定浓度氯化镉可引起HEK细胞凋亡增加，NAC可以拮氯化镉引起的细胞凋亡。 【关键词】; 镉　镉(Cadmium,Cd)在环境中不能降解，最终通过食物链转移到人体，其生物半减期长达10～30年，故在机体中长期蓄积而造成毒作用〔1〕。镉中毒所致机体损伤机制十分复杂且尚不明确。镉可通过细胞内钙超载、基因表达异常与氧化应激等多种途径引起细胞凋亡。其致细胞凋亡的机制与过程不完全相同，有研究显示〔2，3〕，镉致肝、肾细胞损伤与细胞凋亡关系密切。N?乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种巯基供给体，主要是一种抗氧化剂，具有抗细胞凋亡作用。本实验研究不同浓度的镉对人胚肾细胞存活力、凋亡率的影响以及NAC对染镉人胚肾细胞凋亡的影响，为镉中毒的发病机制和防治研究提供依据。　　1; 材料与方法　　1?1; 主要化学试剂; 氯化镉(CdCl2 2.5H2O)，优级纯；DMEM培养液；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)；碘化丙啶(PI)；胎牛血清；胰蛋白酶。　　1?2; 主要仪器; BB15型CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；BD?FACScan流式细胞仪，SUNRISE酶标仪(瑞典Tecar公司)。　　1?3; 人胚肾(HEK)细胞的培养; 将HKE细胞接种于培养瓶中，用胎牛血清(DMEM)培养液进行培养，每天换液1次。培养条件：95%O2，5%CO2，37℃。　　1?4; HEK细胞活力的测定; 参照四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)〔4〕进行。将长成平层的HEK细胞用0.2%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于96孔板培养24h，待细胞贴壁后分别以不同浓度的CdCl2(0，10，20，40，80μmol/L)处理和40μmol/L CdCl2+1，2，4，8mmol/L NAC处理，每个剂量设6个复孔，37℃孵育3h后，每孔加入15μl MTT(5mg/ml)继续培养4h后吸弃全部培养液，每孔加入150μl二甲基亚矾(DMSO)终止反应，振摇10min，在酶标仪570nm吸收光波长处检测A值，分析各组细胞生长的情况。细胞相对存活率(%)=(实验组A/对照组A)×100%　　1?5; 流式细胞仪检测细胞凋亡; 参照流式细胞术(FCM)〔5〕方法进行。将长成平层的HEK细胞用0.2%胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于细胞培养瓶培养24h，待细胞贴壁后，吸去原培养液，分别以不同浓度的CdCl2(0，10，20，40，80μmol/L)处理和40μmol/L CdCl2联合1，2，4，8mmol/L NAC处理，每个剂量设6个复孔，37℃孵育3h后，每孔加入PI染液，充分振摇，避光静置30min，用BD?FACScan型流式细胞仪进行检测。检测条件在为2W氩离子激光器，输出功率为300nm，激发波长为488nm，发射波长为605nm,测量数据输入HP?300Constor30计算机，应用相应的软件进行资料处理。　　1?6; 统计分析; 采用Excel建立数据库，用SPSS10.0软件进行单因素方差分析及组间差异的显著性检验，两两比较用q检验。　　2; 结果　　2?1; 不同浓度Cd对HEK细胞相对存活率影响(图1); 由图1可见，与对照组(0μmol/L)比较，10μmol/L CdCl2使HEK细胞相对存活率有所降低，但差异无统计学意义，20，40，80μmol/L CdCl2组HEK细胞相对存活率明显降低(Plt;0.01)。　　图1; Cd对HEK细胞相对存活率影响（略）　　2?2; NAC与Cd联合作用对HEK细胞相对存活率影响(表1); 由表1可见，单纯染镉组和各浓度(1，2，4，8mmo