T7噬菌体衣壳蛋白P11原核表达、 纯化及其单克隆抗体制备.docVIP

T7噬菌体衣壳蛋白P11原核表达、 纯化及其单克隆抗体制备 　【摘要】 目的: 表达、 纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11, 并制备其单克隆抗体（mAb）。方法: 克隆并表达T7噬菌体P11蛋白, 其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功表达了P11蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为27 000。获得了1 株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株（2G11）, 其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105。Western blot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性。结论: 成功地制备了P11蛋白及其mAb。 【关键词】 T7噬菌体 P11蛋白 核表达 单克隆抗体 T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体［1］, 基因组为线状双链DNA, 长39 936 bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白PlOA、 次要头蛋白P1OB、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17［2, 3］。T7噬菌体作为一种常见的展示系统［4-6］, 因其载体容量大, 插入片段稳定, 洗涤条件灵活, 生长周期短而被广泛使用。为进一步研究T7噬菌体尾蛋白P11蛋白结构和功能, 并为建立T7噬菌体快速准确的检测方法奠定基础, 我们进行了原核表达、 纯化P11蛋白并制备出具有良好特异性的mAb。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　质粒pET28a(+)、T7 select 103b control, 大肠杆菌Top10株, 大肠杆菌BL21（DE3）以及Sp2/0细胞均由本室保存。限制性内切酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ均购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。NiNTA HisBind resin购自Amersham公司。 　　HRP羊抗鼠IgG和Ig亚类（型）鉴定试剂盒Sigma公司产品。BALB/c小鼠由本研究所实验动物中心提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组原核表达载体的构建 　　以T7 select 103b control质粒为模板, 加入针对G11基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物为: 5′ggaattccatatgatgcgctcatacgatatgaac3′（划线处为Nde I酶切位点）下游引物为: 5′cgggatccttagcgagtcagtagaccag3′（划线处为BamH I酶切位点）。扩增反应的条件为: 94℃变性5 min, 然后进行30个循环: 94℃ 30 s, 58℃ 45 s, 72℃ 60 s, 最后72℃延伸8 min。用胶回收试剂盒纯化PCR产物, 用Nde I和BamH I双酶切PCR产物和pET28a(+), T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌Top10株 , 抽取质粒, Nde I和BamH I双酶切鉴定并测序确认正确, 成功构建重组表达载体pET28a(+)/G11。 　　1.2.2 重组P11蛋白的表达及纯化 　　将pET28a(+)/G11转化大肠杆菌BL21(DE3)。用异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）分别诱导表达4、 6、 8 h, 通过SDSPAGE 分析比较诱导前后结果。挑单克隆接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37℃震荡培养过夜, 按1∶100转接到200 mL培养基中, 37℃培养至A600为0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L, 30℃诱导表达4 h。收集菌液, 以8 000 r/min离心10 min收集菌体, 用缓冲液A（pH7.4、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 1 mmol/L PMSF）重悬细菌沉淀, 经超声破碎细菌后, 以12 000 r/min离心10 min。取上清, 采用DuoFlow系统（BioRad）NiNTA 亲和柱层析, 缓冲液B（pH7.4、 20 mmol/L PB、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰, 120 g/L SDSPAGE鉴定纯化效果。 　　1.2.3 动物免疫 　　用400 μL纯化的p11蛋白（1.0 g/L）稀释于6 000 μL PBS（0.1 mol/L PB、 0.15 mol/L NaCl）并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化, 多点皮下注射免疫BALB/c小鼠（50 μg/只）。1个月后, 经腹腔注射加强免疫, 用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原, 注射剂量同前, 后每隔2周分别进行第3次和第4次加强免疫。