Triton X100洗涤剂对抗原包被效率影响及其对策.docVIP

Triton X100洗涤剂对抗原包被效率影响及其对策 　 作者：李永明, 宋朝君, 张葵, 李琦, 田莹, 金伯泉 【摘要】 　　目的: 观察抗原中残留的洗涤剂成分在间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆时, 对抗原包被效率的影响以及相应的对策。方法: 以卵白蛋白（OVA）、卵运铁蛋白（OT）和本室制备的相应的单克隆抗体（mAb）作为实验模型, 在抗原中加入不同浓度梯度的Triton X100包被ELISA板, 用相应的mAb细胞株培养上清做间接ELISA, 确定Triton X100对包被效率的影响。结果: 当包被抗原中Triton X100的浓度为3×10-6（v/v）时, 可以明显抑制包被效率, 当Triton X100的浓度为1.6×10-4（v/v）时几乎可以完全抑制抗原的包被；在含有一定浓度Triton X100的条件下, 提高抗原的浓度, 或适当增大包被过程中的稀释倍数, 可以明显提高包被效率。结论: 洗涤剂对抗原包被有较强的影响, 在抗体制备过程中, 应尽量提高抗原的初始浓度, 降低洗涤剂的浓度, 设计合理的针对含有洗涤剂抗原的ELISA筛选方案, 是mAb制备成功的关键之一。 【关键词】 抗体 ELISA 洗涤剂 　　随着功能基因组研究的深入, 越来越多的基因表达蛋白作为免疫原用来制备特异性的单克隆抗体（mAb）, 但是部分原核或真核表达的蛋白在制备过程中会用到洗涤剂, 当用这些蛋白制备抗体时, 如果不注意其中残留洗涤剂的影响, 往往在间接ELISA筛选时出现“假阴性”结果, 导致大量阳性克隆的丢失, 甚至抗体制备失败。在用含有洗涤剂的抗原包被ELISA板时, 洗涤剂残留过高, 会严重影响蛋白质的包被效率, 但在保证含有一定浓度抗原的前提下, 适当稀释含有洗涤剂的抗原, 反而可以大大提高筛选的阳性率和阳性克隆ELISA检测的A值。我们用本实验室已有的卵白蛋白（Ovalbumin, OVA）和卵运铁蛋白（Ovotransferrin, OT）及其相应的mAb作为模型, 系统的研究了在抗原中加入洗涤剂Triton X100对包被效率抑制的程度、相应的浓度范围以及解决的方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 试剂和仪器 OVA (Grade Ⅶ）和OT购于Sigma公司, 其相应的mAb antiOVA mAb No.12以及antiOT mAb No.2由本室制备。Triton X100购于华美生物公司, 96孔ELISA板购于CorningCostar公司, 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体购于Pierce公司, 显色底物ABTS购于Sigma公司, 酶标仪为BioRad公司产品。 　　1.2 缓冲液 （1）包被缓冲液: 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液, pH9.5；（2）洗液: 0.15 mol/L PBS 加入体积比为0.5 mL/L的Tween20；（3）稀释液: 0.15 mol/L PBS加入体积比为30 mL/L的胎牛血清；（4）底物缓冲液: 0.1 mol/L柠檬酸盐磷酸盐缓冲液, pH5.0；（5）显色液: 5 mg ABTS加入到10 mL底物缓冲液中, 再加30 mL/L H2O2 20 μL, 充分溶解。 　　1.3 方法 　　1.3.1 确定不同浓度的Triton X100对抗原包被效率的影响用包被缓冲液分别稀释OVA和OT至2 mg/L, 然后用稀释好的抗原稀释Triton X100, 从1∶5 000开始做倍比稀释至1∶320 000, 再用含有不同浓度Triton X100的2 mg/L的抗原包被ELISA板, 做间接ELISA, 确定不同浓度的Triton X100对抗原包被的影响。 　　1.3.2 Triton X100初始浓度相同的情况下不同抗原浓度对包被效率的影响 将OVA和OT用0.15 mol/L的PBS分别配制成1 g/L、 0.5 g/L、 0.25 g/L的抗原溶液, 然后加入Triton X100, 使其终浓度为10 mL/L。用包被缓冲液稀释抗原, 从64 mg/L开始做倍比稀释至0.125 mg/L, 包被ELISA板, 做间接ELISA, 观察在相同Triton X100浓度的条件下, 抗原浓度对抗原包被效率的影响。 　　1.3.3 间接ELISA 将包被缓冲液稀释好的抗原加入ELISA板, 100 μL/孔, 4℃过夜。洗液洗3遍, 加入相应mAb杂交瘤细胞株的培养上清（抗体浓度约为5 mg/L）, 100 μL/孔, 37℃孵育1 h, 然后用洗液洗3遍, 加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体, 100 μL/孔, 37℃孵育4