SEREX 方法在筛选及鉴定骨肉瘤抗原中应用.docVIP

SEREX 方法在筛选及鉴定骨肉瘤抗原中应用 　 【关键词】 SEREX方法 骨肉瘤 ；抗原 　　0 引言 　　肿瘤抗原及其编码基因的理论研究和实验技术使肿瘤抗原的筛选和肿瘤免疫的研究进入一个新阶段[1]。肿瘤抗原的筛选与鉴定是临床特异性免疫治疗的前提和关键,随着对肿瘤生物学和肿瘤免疫学的深入认识,设计了基于体液免疫的重组cDNA 文库的血清学分析(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX) 方法, 简便易行[2]。本文对SEREX 方法的原理、技术步骤、及其在骨肉瘤肿瘤基因筛选的应用及研究现状作一简要介绍。 　　1 SEREX方法原理 　　重组cDNA 表达文库的血清学分析最早由Pfreundsch 小组建立[2]。SEREX 方法将分子克隆技术和利用患者自体血清对肿瘤细胞的自体分型技术融为一体,不仅可检测抗体反应,而且能在抗原与患者自体血清反应的基础上,直接从分子水平确定具有免疫原性的肿瘤蛋白质(抗原)。此方法的流程主要是以新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA 文库并连接入噬菌体表达载体,以重组的噬菌体转染E. coli 大肠杆菌,将细菌表达的重组蛋白转移至NC膜上,与稀释后的病人自体血清共孵育,用酶联特异性抗人IgG 二抗识别与高滴度血清抗体反应的克隆,阳性克隆随后亚克隆化,分离出单个插入片段,并确定此插入cDNA 的核苷酸序列,在相应的数据库中进行比对,了解其染色体定位和推测可能的功能作用,最后分析该基因的组织表达谱。 　　2 SEREX技术特点 　　SEREX方法与其他鉴定肿瘤抗原的方法比较,有如下特点: ①用新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA文库,避免了体外培养肿瘤细胞以及因过度培养细胞导致的相关抗原基因缺失或不表达; ②将病人血清稀释至1∶100～1∶1 000, 仅检测高滴度的IgG 抗体,使得免疫分析仅限于可诱导出强免疫反应(在同源宿主体内)及有共同T 细胞辅助的抗原; ③cDNA表达克隆的血清分析,不只限于分析肿瘤细胞的表面抗原,它涵盖了由肿瘤基因编码的蛋白质; ④与单克隆抗体技术比较,SEREX 是运用多特异性血清抗体检测在溶解的细菌斑中高度富集的单克隆抗原。因为肿瘤抗原的cDNA 序列可以直接测定,所以也可推导确定抗原的氨基酸序列; ⑤运用northern blots和RTPCR 检测肿瘤抗原的mRNA 的表达,确定肿瘤抗原的组织表达谱。但SEREX 方法也不能检测肿瘤表达的所有抗原,如糖基化的抗原决定簇和在细菌中表达时发生构像改变的抗原决定簇可能被漏检。此外,对某些在肿瘤发展的不同阶段表达的抗原,若取新鲜组织标本的时间与该抗原表达的阶段不一致,也将被漏检。尽管如此,SEREX法仍不失为一种有效、方便的鉴定肿瘤抗原的方法。 　　3 SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用和问题 　　根据SEREX技术，廖博等[ 3,5]已完成了人骨肉瘤9901及9607细胞cDNA表达文库的构建和鉴定，廖博等在构建人骨肉瘤9901时[3]，所建文库容量为1.5×106。根据Clare 公式[4]计算所需文库的大小，计算公式是：N＝ln（1－P）/ln（1－1/n）（N 为所需克隆数，P 为要求的概率，1/n 为低丰度mRNA在总mRNA 中所占比例。若要99％的概率得到一个低丰度克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105。其所建文库保证了低丰度基因的有效克隆，符合标准，插入片段平均在1.4kb以上，且大小各不相同，多样性好，故适合用于筛选目的克隆。在构建人骨肉瘤9607时[5]，所建文库容量为1.3×106。根据Clare 公式，若要99％的概率得到一个低丰度克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105，所建文库也保证了低丰度基因的有效克隆，符合标准，插入片段平均在1.3kb以上，且大小各不相同，多样性好，也适合用于筛选目的克隆。 　　Yuki等[6]也成功的构建了人骨肉瘤2000细胞cDNA表达文库。Yuki等所建文库容量为3×106，插入片段平均在1.5kb以上。 　　美国克隆技术公司关于良好基因文库的质量标准是： 原始库的重组子数大于5×105～5×107，重组百分率大于90%，插入cDNA片段不小于0.3kb，平均插入片段大于1.0kb以上所建文库都是经过反复多次试验才成功建立起来的质量合格的骨肉瘤cDNA文库。 　　由上可见，虽还未筛选出骨肉瘤的特异性抗原，但成功的构建出的骨肉瘤的cDNA表达文库为进一步从中筛选出骨肉瘤特异性抗原，为建立临床免疫治疗体系、制备出骨肉瘤疫苗以及为骨肉瘤的血清学诊断创造了必要的条件。 　　4 SEREX 技术存在的问题及改进 　　4.1 cDNA文库的质量 cDNA