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VEGF 基因在胃癌中表达及其意义 　【摘要】 目的：探讨VEGF基因在胃癌组织中的表达及意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测48 例胃癌组织及30 例正常组织中VEGF基因的表达。结果：48 例胃癌组织标本中有29 例表达VEGF基因，而30 例正常组织均不表达VEGF基因，两组比较差异有显著性(Plt;0.05) 。结论：VEGF基因在胃癌组织中有较高的表达,对胃癌病人的免疫治疗和预后有重要意义。 【关键词】 VEGF基因； 胃癌； 逆转录PCR 　　胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其恶性程度与各种癌基因、肿瘤抑制因子及几种生长因子及其受体异常有关［1~4］。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor， VEGF)是恶性肿瘤细胞分泌的一种细胞因子，在促血管生成的各种调节因子中，VEGF是作用最强的一种促血管生成因子，可以促进肿瘤组织中新生血管的形成,从而有利于肿瘤的生长及进展。然而，VEGF在胃癌表达的分子机制尚未清除。本研究用RTPCR方法研究胃癌组织的和VEGF的表达,为胃癌的发生、发展、肿瘤组织中血管形成、转移及治疗提供新的途径和理论依据。 　　1 材料和方法 　　11 材料所有标本均来自本院2004年9～2006年9月间的外科手术及胃镜标本。包括癌组织及距癌灶5cm以上的癌旁组织，共收集标本48例，其中男性28例，女性20例；高中分化27例，低分化21 例，20例可见淋巴结转移；年龄24～78 岁，平均年龄61.7岁。所有患者术前未经过化疗或放疗，病理类型为粘液腺癌、管状腺癌、印戒细胞癌。Trizol购自invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自MBI公司。 　　12 方法 　　121 RNA 的提取 Trizol法提取总RNA：组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol（约2ml）冷冻匀浆，室温孵育5min，加入氯仿（0.2ml氯仿/1mlTrizol）用力振荡15秒，室温孵育2~3min，4℃，12000rpm离心15min，取上清，加入异丙醇（0.5ml异丙醇/1mlTrizol），室温孵育60min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀一次（至少1ml75%乙醇/1mlTrizol），4℃，7500rpm离心5min，弃上清，风干沉淀，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。 　　122 cDNA 的合成 反应体积为20μL，反应条件如下：MgCl2 5mmol/ L，10 ×逆转录缓冲液2μL, dNTP1mmol/ L ,逆转录酶15U ,核酸酶抑制剂0.5 U，Oligo (dT) 15 引物0. 5μg ,模板RNA 1 ug，加无RNase水至终体积20μL。42 ℃反应1h ，99 ℃加热5min，然后快速冷却至4 ℃，以灭活逆转录酶,并防止逆转录酶与cDNA结合，逆转录得到的cDNA用作PCR反应的模板。 　　123 PCR引物 合成VEGF引物及内参照GAPDH 引物。VEGF引物序列为： 5’ATGGCAGAAGGAGGAGGG 3和 5’CGAAACGCTGAGGGAGGCT 3’，GAPDH 的引物为：5CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA 3’和5ATGATC TTGAGG CTG TTG TCA TA 3’。 　　124 PCR 扩增 两对引物的反应体系均为25μL, VEGF 反应体系包括cDNA 产物2μL, MgCl2 1. 5mmol/ L, 10 ×Buffer 2. 5μL，dNTP 0. 04 mmol/ L ,引物浓度0. 5μmol/ L, Taq 酶1U，加去离子水至终体积25μL，混匀后滴加无菌石蜡油覆盖液面，瞬时离心后置PCR 扩增仪中扩增扩增条件为94 ℃预变性5min，然后94 ℃55 sec ,50 ℃55 sec ,72 ℃1min24sec，共35个循环,最后72 ℃延伸5min。GAPDH 反应体系包括：cDNA模板2μL ，MgCl2 1. 5mmol/ L，10 ×Buffer2. 5μL , dNTP 0. 2mmol/ L ，引物0. 5umol/ L ，Taq 酶1U ；PCR 扩增条件为94 ℃1min ,55 ℃1min ,72 ℃1min 24sec，共30 个循环,然后72 ℃延伸5min。取10μL 扩增产物于含溴化乙锭的1. 5%琼脂糖凝胶中电泳, 80V, 1h，紫外透射仪观察结果，VEGF基因阳性扩增条带为420bp ，内参照基因GAPDH 扩增条带为200bp 。 　　　13 统计学分析数据用SPSS10. 0 软件处理,两组比较采用χ2检验。