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一氧化氮合成酶及心钠素在豚鼠耳蜗分布 　 【关键词】; 心钠素;,一氧化氮合成酶;,免疫荧光双标染色 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 观察豚鼠耳蜗局部心钠素（ANP）和一氧化氮合成酶（NOS）免疫组化反应产物的分布及其相互关系, 为研究ANP和NOS在豚鼠耳蜗局部血流、 淋巴以及神经调节中的相互作用提供形态学研究的依据。方法: 采用免疫荧光组织化学双标法观察ANP和NOS在正常豚鼠耳蜗的分布特征。结果: 在耳蜗各转螺旋动脉和血管纹均发现ANP和NOS双阳性表达, 螺旋缘、 螺旋韧带和Corti器, 耳蜗神经节细胞有ANP和NOS双阳性染色。结论: ANP和NOS的分布特点显示, 二者在内耳血流调节, 内、 外淋巴平衡调节以及神经信号传递等方面可能存在密切的相互作用。 毕业论文 　　[关键词]心钠素; 一氧化氮合成酶; 免疫荧光双标染色 毕业论文 　　对一氧化氮（nitric oxide, NO）的研究表明, 其作为一种强有力的血管扩张因子, 存在于豚鼠耳蜗血管内皮、 神经节细胞及毛细胞中, 通过直接激活ATP敏感的钾离子（KATP）通道使豚鼠蜗轴螺旋动脉（spiral modiolar artery, SMA）的内皮及平滑肌细胞浓度依赖性地去极化, 引起血管扩张[1]。NO合成的关键酶一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）主要分布于内外毛细胞、 蜗神经节细胞及耳蜗血管纹[1]。心钠素（atrial natriuretic peptide, ANP）也具有强大的扩张血管、 增加组织血流量及调节局部组织水电解质平衡等作用。ANP在内耳分布于螺旋韧带、 Corti器、 螺旋神经节、 血管纹及SMA等处, 参与调节耳蜗血流与内耳微循环平衡状态[2]。本实验我们采用免疫荧光双标的方法研究NO与ANP在内耳结构中的分布特点, 探讨NO与ANP对耳蜗局部环境的影响及其相互间作用。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; 健康红目白色豚鼠, 雌雄不限, 体质量250～350 g, 购自第四军医大学实验动物中心。兔抗大鼠uNOS多克隆抗体为labvision公司产品, 小鼠抗人ANP单克隆抗体（mAb）为Chemicon公司产品, 购于晶美生物工程有限公司。Cy3标记羊抗兔IgG为Sigma公司产品, FITC标记山羊抗小鼠IgG为中杉金桥公司产品, 购于武汉博士德生物公司。 毕业论文 　　1.2; 方法 毕业论文 　　1.2.1; 组织标本制备; 豚鼠5只, 戊巴比妥钠（60 mg/kg, 腹腔注射）麻醉后开胸, 经升主动脉灌注生理盐水300 mL冲出血液, 用40 g/L多聚甲醛500 mL（4℃）灌注固定1 h。取双侧耳蜗, 刺破圆窗膜,置于上述固定液中过夜; 后置于100 g/L EDTA（25℃）脱钙7～14 d, 移入250 g/L蔗糖缓冲液4～6 h后, 用OCT包埋, 平行蜗轴10 μm进行连续冰冻切片备用。 毕业论文 　　1.2.2; 免疫荧光染色; 冰冻切片滴加1∶500稀释兔抗大鼠uNOS多克隆抗体, 4℃孵育24 h; 甩去玻片多余液体, 直接添加1∶500稀释小鼠抗人αANP mAb, 4℃孵育24 h。001 mol/L PBS（pH74）洗3次, 避光同时添加二抗（稀释度均为1∶100）, 37℃孵育30 min后, 避光条件下001 mol/L PBS洗3次, 共聚焦显微镜下观察并拍照。 毕业论文 　　2; 结果 ; 　　镜下可见, 在耳蜗各转的血管纹均有ANP和NOS分布（图1）。耳蜗各转螺旋韧带可见ANP和NOS较多分布（图1）。在窝轴螺旋动脉, 主要分布在血管内膜（图1、 2）。耳蜗各转Corti器中毛细胞及支持细胞可见二者分布（图1）。另外, 螺旋缘（沟状垫）亦可见二者分布（图1、 2）。前庭膜及盖膜均无分布（图1）。可见耳蜗各转神经节细胞及其相应神经纤维束分布量较多, 有少数单纯绿色荧光为主的神经细胞（图2）。 毕业论文 　 　　3; 讨论 　　有研究认为, NO主要通过上调第2信使cGMP的表达, 使平滑肌细胞内平滑肌纤维舒张, 从而扩张SMA[3]。已知ANP主要通过与ANP受体相结合后催化胞膜型鸟甘酸环化酶（GC）产生大量cGMP, 从而影响离子通道、 蛋白激酶等, 发挥相应信号调节功能[4]。Rachel等[5]研究发现ANP可增加前庭的血流量, 并有剂量依赖性, 同时ANP的舒张血管作用也依赖于cGMP。血管纹ANP和NOS的大量分布, 提示ANP和NO可能在此处发挥对局部血流量及蜗管中内淋巴液平衡的调控作用。螺旋韧带ANP和NOS共同分布, 说明ANP和NO可能作用于螺旋韧带引起局