β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化及活性分析.docVIP

β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化及活性分析 　 作者：李黄金,陈伟,赵林,黄志健 【摘要】 目的 构建含εNH2标记位点的克隆酶供体免疫分析(CEDIA)系统供体片段。方法 从大肠杆菌基因组克隆β半乳糖苷酶(βgal)的α片段基因，通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变，与硫氧环蛋白(Trx)融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析。结果 克隆的α片段为βgal N端1-56多肽片段，定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上，且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性，其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的，且与野生型α片段的基本一致。结论 α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力。 【关键词】 β半乳糖苷酶;供体;标记位点;互补 　　(School of Life Sciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou,Guangdong 510006,China)Abstract:Objective To introduce an internal εNH2 for conjugated analyte into donor of cloned enzyme donor immunoassay ( CEDIA ).Methods α gene of βgalactosidase was cloned from Escherichia coli,and introduced lysine code by sitespecific mutagenesis. α genes were fused to Trx tag and expressed under the control of promoter T7 in E. coli Origami (DE3),then screened by complementation assay with Δα fragment after purification.Results An αgene coding 156 aa was cloned,then three mutants R14K、R53K and R14K/R53K were obtained by changing arginine into lysine. The overexpression products of αgenes were purified to a purity over 90%. Of three mutants,R53K showed the highest activity,which was identical to native α fragment’s and far higher than other mutants’.Conclusion Mutant R53K could be potentially used as a donor containing internal εNH2 for CEDIA. 毕业论文 　　Key words: βgalactosidase; donor; conjugation site; complementation 　　克隆酶供体免疫分析(cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA)技术是一种基于β半乳糖苷酶(βgal)α互补的均相酶免疫分析技术[1]，由于特异性强、灵敏度高、且操作简单而快速，目前已广泛应用于临床检验、药物滥用筛查、食品有害残留检测与环境污染监控等方面[2，6]。CEDIA系统由βgal酶供体(α片段)、受体(Δα片段)、标记抗原(待测物)和抗体组成，抗体与标记抗原的结合可导致βgal互补活性的下降，而当样品中含有待测抗原时，待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，并最终表现为样品中的抗原浓度与酶活性呈正相关。由于对受体片段的任何化学修饰均会导致其互补活性的丧失[7]，所以抗原只能标记于较小的供体片段。εNH2是最具标记活性的基团之一[8]，但天然供体片段中缺乏含εNH2的赖氨酸。本文报道了一种含εNH2基的、具有作为CEDIA供体片段潜力的βgal α片段突变体。 论文代写 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本室保存，大肠杆菌Origami(DE3)和表达载体pET32a 为Novagen公司产品;Taq酶、限制性内切酶、T4 D