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一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞制备 　 作者：李华， 汪根树， 张剑， 姜楠， 贾昌昌， 杨扬， 陈规划 【摘要】 【目的】 制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞。 【方法】 逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrx cDNA，应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞。白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定，MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测。【结果】 克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒，感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性。制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞，免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常，MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P lt; 0.05)，并可有效增殖。【结论】 成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞。 【关键词】 肝细胞; 人硫氧还蛋白; 基因修饰 　Abstract： 【Objective】 To prepare the human thioredoxin (hTrx) gene-modified hepatocytes. 【Methods】 hTrx cDNA was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)， recombinant retrovirus was applied to primary cultured rat hepatocyte for infection to generate hTrx gene-modified rat hepatocytes， whose viability and antioxidative capacity were examined with albumin-immunohistochemical staining and MTT assay， respectively. 【Results】 The hTrx open reading frames cDNA was cloned and assembled with recombinant retrovirus， then eukaryotic cells infected by this virus were capable of expressing bioactive hTrx in the form of fusion proteins. Immunohistochemistry demonstrated normal function of the hTrx gene-modified hepatocytes， which possessed strong antioxidative capacity as shown by MTT assay and could be proliferated effectively. 【Conclusion】 The hTrx gene-modified hepatocyte with more stronger antioxidative capacity is prepared. 　　人硫氧还蛋白(human thioredoxin， hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX构成的氧化还原系统广泛存在于组织细胞中，具有清除自由基和维持体内稳定的氧化还原状态的重要作用，对缺血再灌注损伤有明确的保护作用。Trx也可通过对转录因子如NF-κB等的调节作用，促进细胞的增殖及抑制细胞的凋亡等[1-2]。研究发现Trx对肝细胞生存生长具有明显的促进作用[3]，同时其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。但能否持久地促进肝细胞的增殖，减少凋亡和氧化应激成为Trx应用的关键。本实验成功进行了hTrx基因修饰肝细胞的制备，修饰后的肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细胞损伤等。 　　1 材料和方法 　　1.1 hTrx cDNA基因克隆 　　根据GenBank中hTrx cDNA 序列(J04026)设计引物，引入BglⅡ、BamHⅠ酶切位点，并加入对框序列TT(不含终止子TAA)。引物：正向5′- GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，反向5′-GCGGATCCTTGACTAATTCATTAATGGTGGCTT C-3′。异硫氰酸胍一步法从143(TK-)人骨肉瘤细胞中提取模板RNA。应用锚定引物oligo(dT) 15逆转录合成cDNA第一条链，聚合酶链反应(PCR)扩增hTrx cDNA基因，插入载体质粒pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM/hTrx，并进