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乌头简单序列重复区间扩增条件优化 　 作者：张岳峰 万里翔 侯大斌 【摘要】 　　目的保证乌头ISSR-PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性,亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR-PCR体系。结果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 μmol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/μl、甲酰胺2%及退火温度（Tm-3）℃的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR-PCR体系反应稳定，能用于乌头的ISSR分析。 【关键词】 乌头 简单序列重复区间 优化 　　Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR_PCR and reliability of genetic diversity, sibship analysis and source assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in southwest of China were selected to carry out 4 factors(Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal design experiment. Meanwhile separated experiments for forma-mide, template concentration and annealing temperature affect were carried out.ResultsISSR_PCR reaction system could be well established through orthogonal design experiment by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISSR-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb. genetic analysis. 　　Key words：Aconitum carmichael Dexb.; Inter-Simple Sequence Repeat; Optimization 　　乌头Aconitum carmichael Dexb．为毛茛科乌头属植物，别名五毒根［1］。为毛茛科植物乌头，在中国西南地区四川盆地有较大栽培面积，其母根叫乌头或川乌，为镇痉剂，可用于治风痹、风湿神经痛。侧根（子根）入药，称附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。 　　ISSR-PCR技术，简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkiewicz等［2］1994年创建的，引物是根据基因组内某一重复序列设计出一系列特异性引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微卫星片段。这种技术除具有RAPD优点外，比RAPD技术更具有明确的针对性，同时由于PCR扩增条件中的退火温度较高(50℃左右)，保证了PCR扩增的可重复性，结合了SSR和RAPD的优点。可以快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性, 有很好的重复性, 操作简单、成本较低, 适合大样本的检测［3］。关于野生乌头的RAPD的优化与遗传分析已有报道［4］，川乌ISSR遗传分析也有报道［5］。因此建立稳定好、重复性强的ISSR反应体系对乌头遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等方面具有重要意义。 　　1 材料 　　从四川绵阳安县晓坝（海拔850 m）已建立的附子资源圃200份附子种质资源类型中筛选出优势代表材料23份（见表1），上年种植，200707采摘顶部功能嫩叶数片，置4℃保存，提取DNA所用。 　　表1 乌头样品引种来源（略） 　　2 方法 　　2.1 DNA提取采用陈亮［6］并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通过紫外和琼脂糖电泳检测其纯度、浓度和完整性后，用以ISSR-PCR优化实验。 　　2.2 反应体系正交实验 采用L9(34)正交实验设计，对Mg2+（大连TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）进行4因素3水平［7］筛选，方案如表2。根据表2制备总体积为