凝胶过滤层析 - 修改资料.pptVIP

2. Gel Chromatography Separate Casein and Riboflavin by Sephadex G-75 Purpose principle of separating riboflavin (核黄素) and casein by Sephadex G-75 basic operation of gel chromatography (凝胶层析) 凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography） 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 固定相（凝胶） 三维空间网状结构 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 分配系数（Kd） 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 典型的凝胶类型 交联葡聚糖凝胶：Sephadex?? 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ?? 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel?? 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。 基本骨架：葡聚糖（dextran）;交联剂：3-氯-1 ,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 葡聚糖凝胶 理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异： 膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) ： G类的型号：每克干凝胶吸水量（ml）x 10， 如G-75：每克干凝胶吸水量为7.5 ml 筛孔的大小 分级范围 葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样 凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。 类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 应用 分离纯化 脱 盐 测分子量 其它条件选择 1. 柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释 柱长而窄,则柱的管壁效应较大,造成拖尾现象 2. 样品的选择 量适当, 粘度小 3. 洗脱液的选择 每种样品分离所用的缓冲洗脱液,应根据使样品稳定的原则