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佛手种质资源遗传多样性随机扩增多态性DNA分析 　【摘要】 目的研究佛手种质资源多样性和遗传关系。方法采用随机扩增多态性随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析了佛手13份种质材料的亲缘关系。结果从110条引物中筛选出16条多态性高的引物，共扩增出185条DNA带，其中多态性带有168条，多态率为90.8%。通过聚类分析，在相似系数0.67的水平上将13份材料分为3类。结论佛手种质间存在较丰富的遗传多样性，聚类结果与以产地为依据对佛手进行品种类群划分较为一致。 【关键词】 佛手 随机扩增多态度性DNA分析 遗传多样性 佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle(CMS)为芸香科柑桔属植物，其干燥果实入药，具有舒肝理气、和胃止痛的功效［1］。佛手悠久的栽培历史，形成了一些各具特色的地方品种，药材现行规格按产地主要分为广佛手、川佛手和浙佛手［2］。目前，有关佛手种质资源的研究很少，对其种质资源的多样性和遗传结构缺乏系统的研究。随机性扩增多态性DNA（RAPD）技术是20世纪90年代发展起来的一种快速便捷的分子标记技术，已被证明是研究植物遗传多样性及种质鉴定的有效手段，广泛应用于药用植物种内、种间及近缘属间系统学研究［3～5］。本文拟采用RAPD技术分析佛手不同产地、不同栽培品种的亲缘关系及遗传多样性，旨在探究其基因组上的差异，为佛手种质资源的评价和育种提供分子依据。 　　1 器材和方法 　　1.1 材料佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle(CMS)的叶片，经广州中医药大学鉴定教研室张丹雁教授鉴定。样品来源见表1。 　　1.2 仪器与试剂Beckman -15CSR冷冻高速离心机； PCR仪(Applied Biosystems 2720 Thermal cycler)；UVP GDS7600型凝胶成像仪；ECAN Spectra FLUOR plus多功能酶标仪。大连宝生物DR001AM PCR扩增试剂盒；上海生工随机引物；上海生工进口分装琼脂糖；上海申能博彩3 s柱离心式植物基因组DNA试剂盒；天为时代DNA Marker(200 bp DNA Ladder plus)；其他试剂均为国产分析纯试剂。 　　表1 样品来源（略） 　　1.3 方法 　　1.3.1 佛手总DNA的提取和检测采用上海申能博彩公司的3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒提取。将提取到的DNA用纯水稀释10倍后，用酶标仪分别测定其在260，280 nm处的吸收值，计算出OD260与OD280的比值及DNA浓度，并以1.5%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果的优劣。 　　1.3.2 佛手RAPD反应体系和扩增程序在对佛手PCR扩增体系优化后，确定反应的总体积为25 μl ，包括： MgCl2 2 μl (25 mmol/L )，引物1.5 μl(10 μmol/L)， dNTPs 2μl （2 mmol/L），10×buffer缓冲液3 μl，0.3 μl Taq酶（5 U/μl），60 ngDNA样品。 　　PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性1 min,35℃退火l min, 72℃延伸1.5 min，40次循环，最后72℃延伸10 min，－20℃保存。 　　1.3.3 引物筛选选取德庆、青衣童子两种地理位置差异较大的DNA样品做模板，用110个引物(S1～S100, S220～S229) 对其进行PCR扩增筛选。 　　1.3.4 扩增与产物检测13个佛手DNA样品作为扩增模板，用筛选的引物及条件进行RAPD反应，扩增产物经电泳、染色后在凝胶分子成像仪上检测并拍照记录。 　　1.3.5 数据分析将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成RAPD表型数据矩阵。统计每条引物扩增出的总带数和多态性带数，计算多态性位点百分率p=(k/n)×100%（其中k是多态位点数目；n为所测位点总数）。利用NTSYSpc-2.10e求出Nei-Li相似系数矩阵，用UPGMA法对其进行聚类分析。 　　2 结果 　　2.1 引物筛选110个引物中有51条引物扩增出条带，每条引物扩增带数1～15条，平均6条，扩增的谱带分子量大小在300～2 200 bp，16条引物扩增的多态性带相对较多，且条带清晰、重复性好。 　　　2.2 扩增产物的多态性分析以16个10 mer引物对供试的13份材料进行PCR扩增，统计结果见表2。16个引物共扩增出185条带，其中多态性带有168条，占90.8%；平均每个引物可扩增出11.6条带，平均每份材料可扩增出14.2条带，扩增的谱带分子量大小在