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供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌实验探究 　 作者：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰 ［摘要］目的: 观察供者淋巴细胞输注（DLI）对小鼠H22肝癌的治疗作用。 方法: 荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组（A组）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化疗组（B组）、DLI组（C组）及5.FU加DLI组（D组）4组。比较各组小鼠生存期、抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测NK细胞及IL.2的活性。 结果: B、C组生存时间长于A组（Plt;0.01），D组长于C组（Plt;0.01）;B、C、D各组抑瘤率依次为61.3%、34.7%、89.5%;C、D两组NK细胞及IL.2活性明显高于A、B组（Plt;0.05）;病理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。 结论: DLI对小鼠H22肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。 　　［关键词］ 肝癌;供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应;免疫治疗;小鼠 　　随着现代生物技术的发展，生物治疗已逐渐成为治疗肿瘤的重要手段之一。目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本研究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免疫治疗方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　BALB.C小鼠、KM小鼠，雌性，均为8～10周龄，体重18～22g，由东南大学医学院实验动物中心提供。 　　1.2 试剂 　　环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;5.氟脲嘧啶（5.FU）为天津金耀氨基酸有限公司产品。 　　1.3 实体型荷瘤鼠模型建立 　　无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤细胞超过90%，调细胞浓度为1×10 7 ml -1 ，分别取0.2ml接种于KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。 　　1.4 实验分组 　　共分4组，每组10只（另备3只中途处死）。A组（荷瘤对照组）:不作任何处理;B组（5.FU化疗组）:接种后第3天开始化疗，5.FU20mg#12539;kg -1 腹腔注射，连续用药7d;C组［供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte in-fusion，DLI）组］:接种前11d经脾细胞加CP加供体脾细胞输注的方法［1］ 诱导对BALB.C小鼠的特异性免疫耐受状态，接种后第3、10、17天尾静脉注射供鼠BALB.C脾脏淋巴细胞，细胞数分别为0.5×10 7 、0.5×10 7 及1×10 7 只 -1 。D组（5.FU加DLI组）:接种前4d诱导免疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第10、17、24天予DLI，细胞数同C组。 　　1.5 观察指标 　　1.5.1 生存时间 记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算各治疗组生命延长率。 　　1.5.2 抑瘤率 待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑瘤率。肿瘤体积=长径×短径 2 .2;抑瘤率=（对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积）.对照组肿瘤体积×100%。 　　1.5.3 瘤体光镜下组织病理学观察 接种后第15天各组处死3只小鼠取瘤体，固定包埋切片，HE染色光镜观察。常规无菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。 　　1.5.4 NK细胞杀伤活性（NKCA）检测 参照文献［2］的方法略有改动。取上述已制备的脾细胞悬液4×10 6 ml -1 ，加入96孔培养板，每孔100μl，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。取传代48h的H22细胞，调细胞浓度为2×10 5 ml -1 ，每孔加入100μl，使每孔效靶比为20∶1。平行设效应细胞对照孔。按MTT方法加人试剂并测OD值，依下式计算杀伤率: 　　NKCA（%）=［1-（实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值）.靶细胞对照孔OD值］×100%。 　　1.5.5 IL.2的诱生及其活性检测 参照文献［3］T淋巴母细胞增殖分析法。（1）IL.2诱生:取上述已制备的脾细胞悬液5×10 6 ml -1 放入培养瓶，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养40h，离心收集上清液，置-20℃冰箱保存备用。（2）制备活化的脾淋巴细胞:无菌取正常KM小鼠脾脏，制成5×10 6 ml -1 细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5mg#12539;L -1 ，置37℃、体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5×10 5 ml -1 细胞悬液作为检测IL.2的反应细胞。（3）IL.2活性检测:将待测小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定IL.2活性。 　　1.6 统计学处理 　　所有数据采用SPSS统