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叶瓜参多糖活性成分药性分析 　　　海参为海洋棘皮动物，营养丰富、味美可口，具有极高的药用价值，同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一。明代以后，海参收录于本草，作为补益药物[1]。现代研究表明，海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老、防止动脉硬化、糖尿病以及抗肿瘤等作用[2]。叶瓜参（Cucumaria frondosa Gunnerus）属棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothurcidea）、楯手目（Dendrochirotida）、瓜参科（Cucumariidae）的海洋动物。体长一般为50 mm，体型呈圆筒状，体色为棕色或黑色，具有较厚的体壁和坚硬的角质，触手为5个。该物种广泛分布于北极地区，俄罗斯、加拿大、挪威、英国等国海岸均有分布，此外从格陵兰到马萨诸塞的西大西洋水域也有分布[3]。多糖是海参的主要活性成分，主要有黏多糖岩和藻多糖两种[4-5]。国外学者对叶瓜参中的皂苷有过研究[6-7]，但有关叶瓜参多糖的研究鲜有报导。本课题组先期对叶瓜参中的脑苷脂进行了研究[8]。本研究对加拿大纽西兰海域的叶瓜参（C. frondosa Gunnerus）中的多糖成分进行了系统的化学分析和生物活性研究。 　1?仪器与材料 　1.1?实验材料 　叶瓜参新鲜样品，2010年9月采自加拿大纽芬兰海域，标本保存于第二军医大学海洋药物研究中心。 　1.2?仪器 　GL-20G-Ⅱ冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；Alpha-1-2冷冻干燥仪，CHRIST（德国）；超滤装置，上海摩速科学器材公司；BS110分析天平，Sartorius北京赛多利斯天平有限公司；BSZ-100自动馏分收集器，上海青浦沪西仪器厂； GC/MS：Finnigan Voyager GC/MS 联用仪，配DB-5 石英毛细管色谱柱（30 mtimes;0.25 mm，0.25mu;m）。HPLC条件：Aglient 1100 HPLC 仪，示差折光（RID）检测器。 　1.3?试剂 　葡聚糖凝胶，Sephadex G-25 上海仕梵化学有限公司；盐酸、硫酸、苯酚等均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。 　2?方法与结果 　2.1?实验方法 　2.1.1?叶瓜参多糖的提取分离?取叶瓜参新鲜样品，冷冻干燥，粉碎成20目冻干粉。将叶瓜参冻干粉1 000 g加入5倍量的60%乙醇冷浸并搅拌5 h。离心收集上清液，沉淀物继续按上述步骤重复提取2次，合并上清提取液，减压浓缩，得乙醇提取物。将乙醇提取物用5倍量水溶解，Sevage法去蛋白。水层溶液减压浓缩，冷冻干燥，即为叶瓜参粗多糖，称重，计算其得率为5.2%。将叶瓜参粗多糖样品溶解于25倍量的蒸馏水中，利用超滤装置，选用不同的超滤膜（截留分子量为10 KDa、5 KDa和500 Da）对叶瓜参粗多糖进行梯度超滤，得不同分子量的截留液。减压浓缩，冷冻干燥，得不同分子量范围的叶瓜参多糖。 　2.1.2?叶瓜参多糖的纯化?所得到的样品再分别进行葡聚糖凝胶 Sephadex G-25柱层析，蒸馏水洗脱，硫酸”苯酚法跟踪检测洗脱液中的多糖含量，收集均一多糖组分。从分子量为10 KDa的截留液中分离得到CFG-1（得率为5.4%）、从分子量为5 KDa的截留液中分离得CFG-2（得率为6.3%）、从分子量为500 Da的截留液中分离得CFG-3（得率为6.7%）。上述叶瓜参多糖组分经HPGFC检测均单一吸收峰，经紫外扫描不含蛋白质和氨基酸。 　2.1.3?叶瓜参多糖酸水解?取已纯化的叶瓜参多糖各5 mg，溶于2.5 mL三氟乙酸溶液中，置于5 mL安瓿瓶中，充氮气后进行封管。置于水浴中加热反应5 h，然后取出减压浓缩至干。加入5 mg盐酸羟胺和吡啶1.5 mL，置于90℃水浴反应30 min，冷却至室温，加入1 mL醋酐，90℃水浴反应45 min，生成糖腈乙酸酯衍生物，溶于0.5 mL氯仿溶液，进行GC-MS分析。 　GC-MS分析条件：色谱柱 HP-5石英毛细管色谱柱（30 mtimes; 0.25 mm，0.25mu;m） ；柱温 150℃（保持2 min）-300℃（保持10 min）汽化温度 250℃；升温速度 15℃/min；载气（流量）氦气（1.0 mL/min）；质谱检测器源温200℃、EI电离源、电离电压70 eV。 　根据样品测得的吸收峰的保留时间与标准糖进行对照，确定糖的组成。根据样品测得的吸收峰的面积推测糖的摩尔数比。 　2.1.4?叶瓜参多糖蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制活性试验?实验材料和方法：应用大肠杆菌表达后得到蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B。实验中，以 pNPP 为底物，在96孔或384孔平底微孔板内检测酶活性。底物pNPP经PTP1B水解获得的游离产物在405 nm处有