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基因治疗促进脊柱融合探究进展 　 作者：董智勇 邝冠明 郑召民 【关键词】 ,下腰痛 下腰痛(low back pain)给患者和社会带来了沉重的负担，据统计，70％~90％的人一生中会经受腰背痛的折磨，其中10%~20％会发展为慢性下腰痛。脊柱融合术至今仍是对经保守治疗无效的下腰痛患者所采取的一种标准治疗方法。近年来因椎间盘退变性疾病、腰椎不稳等原因接受脊柱融合手术的患者逐年增加，随着此类手术的广泛开展，其存在的问题也逐渐引起了人们的重视。其中最主要的是假关节发生率高、临床疗效不佳〔1〕。为了解决这些问题，人们从脊柱融合的生物学和生物力学等多方面进行了尝试，包括内固定器械的广泛应用及融合技术的改进等，Bono等对过去20年发表的文献综合分析，结果表明所有上述技术改进对融合率和临床疗效均无显著影响〔2〕。这些研究结果促使人们寻找新的研究方向，提高融合率。随后研究的重点逐渐集中在通过生物学方法改进骨移植材料方面。 基因工程和组织工程的发展为解决这一难题带来了希望。大多数研究者认为选择合适的骨生长因子基因、病毒载体、合适的组织工程种子细胞以及支架材料十分重要，相关的研究也多是围绕这些方面展开，并且取得了很多研究成果。 　　1 骨生长因子及病毒载体 　　能够促进骨愈合及脊柱融合的生长因子很多，目前人们研究的主要有以下几种：转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGH)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等，由于上述生长因子均在骨愈合的不同阶段分泌，人们普遍认为这些因子具有潜在的促进骨愈合的能力，逐渐引起了研究者的重视〔3〕。TGFβ超家族成员BMPs已被证实能在骨愈合过程中诱导未分化的间质细胞增殖、分化，诱导骨再生，促进骨愈合；并且在细胞生长及骨形成过程中扮演关键的角色，因而一直处于研究的重点。在已发现的20余种BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7(OP1)的骨诱导能力最强。它们形成软骨和新生骨，在促进成骨及脊柱融合的实验和临床研究中已取得了成功的经验。然而，由于BMP的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用BMP的效果尚未理想，因此，应有合适的载体来调节BMP的释放速度。应用基因工程技术将BMP基因重组入宿主细胞基因组中，使BMP获得持续的表达是这一领域中重要的突破方向，研究者正致力于寻找合适的基因工程方法使其在临床骨科疾病的治疗中发挥作用，这一领域的研究进展极大地促进了脊柱融合的研究。 　　目前有以下几种研究方向：一个研究方向是用原核表达系统进行表达。由于原核细胞内无蛋白质剪切加工系统和糖基化系统，因此BMPs表达产物以包涵体形式存在于细胞浆内，而不能分泌出胞。依据原核细胞的非分泌性表达来获得高产量、高活性的BMPs至今仍有技术难度。第二个研究方向是在真核细胞中进行BMPs的表达。由于真核细胞表达系统培养条件要求严格，分泌型蛋白表达水平低，因此生产成本高，不利于进行大规模生产，限制了从实验研究走向临床应用的发展。第三个研究方向是采用病毒重组技术获得BMPs的持续表达。 　　病毒重组技术是目前研究的重点和热点。逆转录病毒介导的基因转移技术在欧美已用于某些遗传性疾病和骨外疾病的基因治疗〔4〕。但它只整合入增殖期的靶细胞，插入突变的可能性较大，限制了其进一步应用。腺病毒载体具有较大的宿主范围，目前在基因治疗的研究中较多〔5〕。但重组腺病毒仅存在于细胞浆中而不能整合入靶细胞染色体，外源基因只能瞬时表达；而且它存在免疫原性以及野生型病毒污染的可能，安全性值得注意。这促使人们寻找其它更适合BMPs表达的病毒载体。在这种情况下，腺相关病毒(adeno associated virosis，AAV)和慢病毒逐渐引起了人们的重视。人们研究发现AAV几乎可以感染所有已建立的体外细胞系，且野生型AAV对人类无致病性。AAV基因组可以整合入宿主细胞的基因组DNA中，保证了外源基因长期稳定表达；AAV末端重复序列中的转录元件方向不指向宿主DNA，插入突变的可能性很小；该病毒载体可整合入分裂及非分裂期细胞，宿主范围较宽〔6〕。Chen等对AAV在骨组织工程中的应用进行了很多有益的尝试，他首先发现AAVBMP2可以高效转染C2C12细胞，促进成骨，具有极好的应用前景〔7〕，随后他联合应用AAV及腺病毒表达BMP2基因，发现两者均可明显的促进成骨，且具有较好的协同作用，Ad可以促进AAV介导的BMP2的表达〔8〕。在此基础上，Chen等进行了更深入的研究，采用不同的目的基因――BMP4，构建AAVBMP4转染小鼠C2C12细胞，观察到明显的促进成骨作用〔9〕。 　　2 种子细胞 　　种子细胞是组织工程学中的最重要、最基本的环节。作为骨