树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内抗肿瘤免疫保护作用.docVIP

树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内抗肿瘤免疫保护作用 　 作者：李保东，付泽娴，马云龙，薛平，蔡建辉 【摘要】 目的 探讨树突状细胞（DCs）疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫保护作用。方法 制备DCRNA疫苗；建立人源化裸鼠模型；15只人源化裸鼠随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组，每组5只，分别用DCRNA、DCs和PBS皮下免疫注射2次，间隔1周，末次免疫后3天皮下接种胃癌细胞。各组裸鼠外周血人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞的检测和观察GVHD反应。观察裸鼠瘤体积和瘤重。检测细胞因子IL12和IFNγ水平。结果 各组HuPBTL裸鼠外周血中均检测到人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞，无GVHD反应。DCRNA组瘤体积明显小于DCs组和PBS组（P＜0.05）；DCRNA组瘤重明显小于DCs组和PBS组（P=0.0452、P=0.0004），但DCs组和PBS组差异无统计学意义（P=0.0618）；DCRNA组抑瘤率（53.7%）显著高于DCs组（25.1%）（P＜0.05）。DCRNA组IL12和IFNγ水平明显高于DCs组和PBS组（Plt;0.05、Plt;0.01）。结论 HuPBTL腹腔注射，可成功构建裸鼠人细胞免疫功能；DCRNA疫苗在人源化裸鼠体内能诱导产生较强的抗胃癌免疫保护作用。 【关键词】 树突状细胞；疫苗；胃癌；裸鼠；人源化；细胞免疫 树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是体内功能最强的抗原提呈细胞，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应中起关键作用。近年来，国外DCs疫苗Ⅰ、Ⅱ期临床试验治疗恶性胶质瘤[1]、肾癌[2]和结、直肠癌[3]等，说明DCs疫苗是安全可行的。我们前期的实验结果已经证实胃癌总RNA转染的DCs在体外诱导产生抗胃癌特异性CTL[4]，在此基础上，我们观察胃癌总RNA转染的DCs（DCRNA疫苗）在人源化裸鼠体内抗胃癌免疫保护作用。 1 材料和方法 1.1 材料 胃癌细胞株BGC823，由河北医科大学申海涛博士惠赠。BALB/c（nu/nu）裸鼠购于中国医学科学院实验动物研究所，SPF级，4～5周龄，体重18～20g，均为雌性。饲养于河北省实验动物中心SPF级动物实验室，笼具、水和垫料均高压消毒，每3天更换1次。RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，新生牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640完全培养基：以RPMI1640培养基为基础，加10%灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）均为美国Reprotech公司产品。TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司。FicollPaque淋巴细胞分离液购于瑞典Amersham Biosciences公司。尼龙毛购于日本和光纯药工业株式会社。人IL12和IFNγ水平检测ELISA试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品。FITC/PE标记鼠抗人单抗CD4、CD8购于美国BioLegend公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞BGC823培养和胃癌总RNA的提取和鉴定 BGC823常规培养、消化传代，取对数生长期细胞用于实验。消化、离心收集细胞，PBS洗涤3次，按TRIzol试剂盒说明书抽提胃癌总RNA，取少量RNA测定OD260/OD280，计算总RNA含量和纯度gt;1.8；琼脂糖变性电泳可见完整18S、28S两条带，表明总RNA完整未降解。调细胞BGC823浓度为1×107/ml。 1.2.2 DCs的培养及DCRNA疫苗制备的健康成人外周血（肝素抗凝50U/ml）行密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs），PBS洗涤3次，在完全培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养2h后，吸出未贴壁细胞；留下的贴壁细胞，流式细胞仪（FCM）检测其纯度（gt;90%），调整细胞密度为2×106/ml，加入6孔板中，每孔加完全培养基、rhGMCSF100ng/ml和rhIL4 50ng/ml，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，隔天半量换液及添加rhGMCSF和rhIL4。参考文献[2]的方法，第5 天，将imDCs分成2组，1组imDCs用RPMI1640培养基调整密度为1×107/ml，加总RNA 50μg/ml，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中共培养60min进行转染，转染结束后更换培养基继续培养2天；另1组继续培养2天作为对照组。第7天收集全部悬浮和轻微贴壁细胞，PBS洗2次，调整其密度为5×106/ml。 1.2.3 人源化裸鼠模型的建立和DCRNA疫苗抗胃癌免疫保护作用 将吸出的非贴壁细胞，完全培养基悬浮后轻轻注