珠子参皂苷对人早幼粒白血病HL-60细胞增殖抑制及诱导分化探究.doc

珠子参皂苷对人早幼粒白血病HL-60细胞增殖抑制及诱导分化探究 　 作者：陈涛，胡卫 巩仔鹏，翟文海 【摘要】 目的探讨珠子参皂苷对HL-60细胞增殖抑制和诱导分化作用及其机制。方法MTT比色法测定细胞增殖抑制作用;细胞涂片观察细胞形态学改变;硝基四氮唑蓝(NBT)试验测定细胞还原能力;流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。结果72 h后，最低、低、中、高浓度珠子参皂苷组的细胞增殖抑制率分别为51.86 %，42.84 %，49.13 %，66.40 %;细胞形态学观察发现珠子参皂苷组67.1 %细胞分化成熟;NBT还原能力明显增强;细胞被阻滞在G0/G1期。结论珠子参皂苷对HL-60细胞有一定的增殖抑制和诱导分化作用，其作用机理可能与阻止细胞于G0/G1期有关。 【关键词】 珠子参; 皂苷; HL-60; 分化 珠子参Panax japlcus var major又名扣子七，为五加科植物珠子参Panax japonicusC. A.Mey.var. major( Burk.)C. Y. Wu et K. M. Feng或羽叶三七Panax japonicus C. A. Mey. var. bipinnati-fidus( Seem) C. Y. Wu et K. M. Feng的干燥根茎，主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区[1]。它的根茎为药材珠子参，具活血散瘀、补血止血、消肿止痛之功。目前已从珠子参各种属珠子参根茎及叶中共分离出25个皂苷，多数为三萜皂苷[2]。从结构上分析，珠子参皂苷极可能具有诱导肿瘤细胞分化的作用。但到目前为止，珠子参皂苷用于抗肿瘤方面的研究还非常少。本文以人早幼粒白血病HL-60细胞株为对象，用体外细胞培养的方法，初步探讨了珠子参皂苷抗癌及诱导肿瘤细胞分化的作用。 　　1 材料 　　1.1 细胞株人早幼粒白血病HL-60细胞株，购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。 　　1.2 药品与试剂珠子参，产于湖北省神农架林区，经宜昌市药品检验所鉴定。珠子参总皂苷提取方法见参考文献[3]。在超净工作台中，将珠子参皂苷粉末溶于RPMI-1640培养基中，浓度为2 000 μg /ml，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，保存于4℃冰箱中备用。 　　1.3 仪器EPLCS XL-4 流式细胞分析系统;Suprafuge 22高速冷冻离心机;GENios多功能酶标仪。 　　2 方法 　　2.1 实验分组阴性对照组(BL组)：含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液;阳性对照组(ATRA组)：加入全反式维甲酸ATRA溶液，并使终浓度为含10 %胎牛血清100 μg /ml药液(ATRA浓度参照文献[4]);珠子参皂苷组(PJ组)：加入珠子参皂苷药液，并使终浓度为含10 %胎牛血清和800，400，200，100 μg /ml药液4个浓度组，经过细胞毒实验后，确定一个最佳浓度组作为珠子参皂苷组。以上各组培养液均调整pH值为7.2。 　　2.2 细胞培养细胞培养方法参照文献[5]。HL-60细胞复苏后在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液、5%CO2、37℃条件下传代培养，至对数生长期后，分组，加入相应培养基及血清后，调整细胞浓度至2×105个/ml。 　　2.3 细胞毒实验方法参照文献[6]，每组一瓶各取细胞悬液接种于96孔培养板，每组3板，每板设5个平行孔，每孔100 μl，分别在加入血清后24，48和72 h时加入20 μl MTT贮液，使MTT浓度为0.9 mg/ml，继续温育4 h，超速低温离心1 000 r/min，5 min，直接翻板法甩干上清，加入10% SDS 100 μl/孔，振荡5 min，摇匀，以完全溶解微小紫蓝色结晶，迅速于酶标仪570 nm处测定各孔吸光度(OD值)。 　　细胞杀伤率(%)=1-实验组OD均值对照组OD均值×100% 　　2.4 细胞形态学分级每瓶细胞悬液离心，弃上清，取沉淀涂片，迅速风干，Wright-Giemsa染色10 min，蒸馏水轻轻冲洗，风干后，油镜下观察，记数200个细胞，分级标准参照文献[7]。 　　2.5 细胞NBT还原能力检测细胞培养至对数生长期后，将药物加入细胞悬液中，并将细胞终浓度调成1～5×105个/ml，细胞共分3组：阴性对照组、阳性对照组、珠子参皂苷组，培养72 h后，将各组细胞悬液离心，弃上清，加入0.1% NBT溶液0.5 ml和TPA溶液20 μl，37℃孵育1 h后，各组细胞离心，弃上清，取沉淀涂片，迅速风干，Wright-Giemsa染色10 min，PBS轻轻冲洗，风干后油镜下随机计数200个细胞，细胞内有蓝黑色颗粒者为NBT阳性细胞，计算阳性细胞百分率。 　　2.6 FCM细胞周期分析细胞培养至对数生长期后，将药物加入细