白花蛇舌草对白血病CEM细胞抑制作用及诱导其凋亡探究.docVIP

白花蛇舌草对白血病CEM细胞抑制作用及诱导其凋亡探究 　 作者：陈秀珍，朱大诚，王艳辉，尹小明 【摘要】 　　目的研究白花蛇舌草对白血病CEM细胞的抑制作用及其机制。方法采用MTT比色实验检测白花蛇舌草对CEM细胞的抑制率；光镜、电镜技术观察细胞凋亡形态结构的改变；流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率。结果白花蛇舌草能明显抑制CEM细胞的生长，药物浓度在0.025 6 μg/ml即具有显著的抑制作用，抑制率呈剂量和时间依赖性，半数抑制浓度（IC50）约为0.128 μg/ml；光镜、电镜下见细胞体积缩小，细胞膜皱缩，染色质明显浓缩，核聚集，边聚于核膜下呈新月形等典型的凋亡特征；流式细胞术证实白花蛇舌草能诱导CEM细胞凋亡，凋亡率也呈剂量和时间依赖性。结论白花蛇舌草对白血病CEM细胞的生长具有明显的抑制作用，诱导细胞凋亡是其机制之一。 【关键词】 白花蛇舌草； 白血病； CEM细胞； 生长抑制； 细胞凋亡 　　白花蛇舌草Hedyotis diffusa Wilid为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草。在我国主要分布于南方各省区，夏秋季节采收，洗净，鲜用或晒干。其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有清热、解毒、利湿、抗癌等功效。 　　近年来许多学者对白花蛇舌草进行了广泛的研究，特别是其抗肿瘤作用的报道较多，但其对白血病作用的研究较少［1，2］。为此，我们以白花蛇舌草作用人T淋巴细胞白血病CEM细胞株，研究白花蛇舌草抑制白血病CEM细胞株的机制。现报道如下。 　　1 材料 　　白花蛇舌草由江西药都樟树中药饮片有限公司生产，批将白花蛇舌草高速粉碎成碎片状，浸泡于盛有10倍量药材的蒸馏水的圆底烧瓶中12 h后，煎煮3次，收集滤液进行抽滤浓缩，将浓缩液置于旋转蒸发器中，滤液蒸发成粉末，再将粉末准确称重并溶于三蒸水，滤过除菌，配成浓度为220 mg/ml的白花蛇舌草水提液备用。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品，RPMI1640为Gibco公司产品，小牛血清（FBS）为杭州四季青生产，凋亡检测试剂盒为北京保赛生物技术有限公司生产。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养白血病CEM细胞株本实验室保存。培养基为含体积分数为10%的FBS的RPMI1640，并加入双抗（青霉素100 U/ml和链霉素100μg/ml）。在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱（Therno Forma公司产品）中培养。取对数生长期细胞进行实验。 　　2.2 MTT比色实验将CEM细胞悬液离心（1 500 r/min、8 min），台朌蓝拒染法进行细胞计数，调整细胞终浓度为3×105/ml进行实验，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔190 μl，24 h后，实验组分别加入6种不同浓度的白花蛇舌草溶液（终浓度分别为0.005 12，0.025 6，0.128，0.64，3.2，16 μg/ml）10 μl，对照组不加药，微振荡，另设空白组（只有培养基，无细胞）每组6个复孔，培养于3个时间段（24，48，72 h）后，每孔加MTT（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h后，离心（1 500 r/min、8 min），弃上清液，每孔加DMSO 150 μl，避光微振荡，让甲臜溶解充分，置于自动酶标仪，测490 nm处的吸光度（A490）值。抑制率（%）=［（对照组A值-实验组A值）/对照组A值］×100%。 　　2.3 形态学观察白花蛇舌草作用于CEM细胞时间和浓度同MTT比色实验，在倒置显微镜下观察实验组和对照组CEM细胞的一般情况并照像；CEM细胞悬液离心涂片，Giemsa染色，油镜下观察细胞形态；取白花蛇舌草3个浓度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml）作用于CEM细胞，两个时间段（24，48 h）后，制成超薄切片，在透视电镜下观察细胞超微结构及凋亡小体。 　　2.4 流式细胞术（FCM）分析白花蛇舌草3个浓度（0.025 6，0.128，0.64 μg/ml），作用于CEM细胞两个时间段（24，48 h）后，细胞用PBS洗两遍，70%乙醇固定，重悬于PBS中调整细胞浓度为1×106/ml，取100 μl，加碘化吡啶（PI）1 ml，轻轻混匀置4℃冰箱30 min，上机检测（流式仪为 BECTON DTCKINSON，B.D公司产品），采用CenQuest软件上机获取10 000个细胞，ModFitlt软件分析并统计结果。 　　2.5 统计学分析采用双侧t检验 ，求P值。P＜0.05为差异有显著性。 　　　3 结果 　　3.1 白花蛇舌草对白血病CEM细胞生长的影响不同时间和剂量白花蛇舌草对CEM细胞生长的影响见表1。0.025 6 μg/ml的白花蛇舌草即可显著抑制CEM细胞生长，半数抑制