类风湿性关节炎RF阳性及阴性患者外周血CD4+细胞基因表达差异.docVIP

类风湿性关节炎RF阳性及阴性患者外周血CD4+细胞基因表达差异 　 作者：吕诚, 徐世杰, 肖诚, 阎小萍, 赵林华, 王建明, 李梢, 吕爱平 【摘要】 　　目的: 研究RF因子阳性及阴性RA患者之间是否存在基因组学的差异, 探询差异存在的基因表达基础。方法: 应用基因表达谱方法来检测上述两型患者CD4+淋巴细胞基因表达情况。结果: RF因子阳性与阴性患者之间有55条基因表达差异有统计学意义。结论: RF因子阳性与阴性RA患者之间存在差异表达基因, 这些差异基因多与免疫应答相关。 【关键词】 类风湿性关节炎 类风湿因子 基因表达 　　类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是以周围关节对称性炎症为主、 伴反复发作的慢性全身性疾病, 患者中关节局部致残率高达60%以上, 是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病, 其病因目前尚不十分明确, 主要与遗传、 感染、 激素、 免疫因素等相关[1]。近期研究表明: RA的发生发展与CD4淋巴细胞改变关系密切, 关节滑膜中浸润的CD4+T淋巴细胞对自身抗原产生特异性免疫应答, 促进单核巨噬细胞的活化核细胞毒性T细胞的分化, 导致炎症细胞因子释放, 形成炎性损伤。类风湿因子（rheumatoid factor, RF）是临床诊断和治疗RA过程中最常用的检测项目之一, 它在RA中的阳性率约为60%～80%, 但特异性低[2, 3]。为了探询RA中RF阴性与阳性患者之间是否存在基因表达差异, 我们利用基因芯片技术对RA患者外周血CD4+细胞进行了检测与研究。 　　1 对象和方法 　　1.1 对象 RA患者33例来自北京中日友好医院风湿病科及中国中医科学院西苑医院风湿病科, 均为女性患者, 年龄21～60岁, 平均（42.8±9.9）岁, 病程2～10年, 平均（3.8±4.9）年; 其中RF+患者22例, 年龄21～60岁, 平均（41.6±10.9）岁, 病程2～10年, 平均（5.05±1.81）年; RF-患者11例, 年龄34～60岁, 平均（45.1±7.4）岁, 病程2～8年, 平均（4.91±1.45）年。疾病诊断参照1987年美国风湿病学会（ARA）修订的诊断标准[4], 病例排除标准包括: 合并严重关节外表现, 如高热不退、 多发类风湿结节、 肺间质纤维化、 肾脏淀粉样变、 缩窄性心包炎、 血管炎等需要使用糖皮质激素的患者; 虽为本病患者, 但长期服用有关治疗RA的慢作用药物, 且在本研究前至少1周内未停用甲氨喋呤、 氯喹、 柳氮磺胺吡啶、 环磷酰胺、 青霉胺和金制剂等免疫抑制类药物的患者; 合并有循环、 呼吸、 消化、 泌尿生殖、 造血系统以及中枢神经系统等严重疾病的患者; 精神病患者; 孕妇或哺乳期女性的患者; 过往用药记录不明确者。另选中国中医科学院西苑医院体检中心12名体检者作为对照, 对照组为正常体检人群, 经体检后其心电图、 血脂、 血糖及肝功能均无异常。所有纳入者均采集晨起空腹静脉血6～8 mL, 肝素抗凝备用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 CD4+T淋巴细胞分离纯化 采集的静脉血, 以体积比为50 μL/1 mL血液的比例, 将CD4+ enrichment抗体加入血液中混匀, 室温下放置20 min。含胎牛血清的PBS等量稀释样本, 轻轻混匀, 将混合液体小心加到Ficoll密度介质上, 形成分界面, 室温下1200 g速度离心20 min。用一次性吸量管在密度介质层与血浆层之间收集淋巴细胞, PBS清洗, 冰氯化铵溶解残存红细胞, PBS清洗2遍, 即可得到纯度90%以上的CD4+T淋巴细胞。 　　1.2.2 RNA提取及鉴定 按TRIzol说明书, 提取细胞总RNA, 并进行RNA鉴定, 其A260/A280比值必须不低于1.7。aRNA制备: 根据MessageAmp aRNA试剂盒操作说明进行。用T7 Oligo(dT)逆转录合成第1条cDNA链, 以第1条cDNA链为模板合成第2条cDNA链, cDNA链纯化, 体外转录合成aRNA, aRNA纯化, aRNA鉴定及含量测定。 　　1.2.3 标记的aRNA探针与基因表达芯片杂交及检测 芯片由University of British Columbia、 Canada提供, 为全基因组序列, 共23232个点, 设有空白对照、 阴性对照、 管家基因对照。根据PerkinElmer Micromax ASAP RNA labeling试剂盒操作说明进行。所有芯片均以相同对照标记为Cy3, 样本标记为Cy5。 　　1.2.4 基因芯片图像扫描 用GenePix 4000B scanner进行图像扫描。