类风湿性关节炎基因治疗病毒载体及基因转移方法探究进展.docVIP

类风湿性关节炎基因治疗病毒载体及基因转移方法探究进展 　 ; 作者：刘国玲 综述 梁统, 周克元 毕业论文 【关键词】; 类风湿性关节炎（RA）;,基因治疗;,载体 毕业论文 　　[关键词]类风湿性关节炎（RA）; 基因治疗; 载体 毕业论文 　　类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）, 是一种病因尚不清楚的慢性全身免疫性炎症疾病, 其发病机制也不完全明了。常规的药物治疗及外科手术治疗等均不十分理想, 尚缺乏有效的治疗手段。最近研究表明, 基因治疗显示出了较好的前景。基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷而发挥治疗作用, 从而达到治疗目的的生物医学高技术。基因治疗中表达载体的构建是治疗成功与否的关键, 理想的载体应该是滴度高、 能转染大量的细胞, 制备方便且重复性好, 能定向进入目的细胞并整合到宿主染色体特异定位点, 能以附加体的形式稳定存在, 转录单元有可调控的操纵元件, 以及不含能激发免疫应答的组分。目前, 在RA的基因治疗中使用的载体系统主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。 毕业论文 　　1; 病毒载体系统 毕业论文 　　病毒载体是指以病毒为基础的基因载体, 是对病毒基因组进行操作和改造, 使之能携带外源基因和相关基因元件, 并被包装成病毒颗粒, 而构建的基因导入系统。目前在RA的治疗中主要有下列几种类型病毒载体: 毕业论文 　　1.1; 反转录病毒载体; 反转录病毒属于正链RNA病毒, 是最先被改造且应用最为广泛（gt;50%）的基因治疗载体。其基因组大约为10 kb, 含有3个最重要的基因: 即gag（编码核心蛋白）、 pol（编码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。基因排列的顺序是5′gagpolenv3′, 两端存在长末端重复区（LTRS）用于介导病毒的整合, env基因中含有病毒包装所必需的序列。反转录病毒载体具有转染率高, 可稳定整合表达、 宿主范围广泛及对宿主的毒性小等优点, 在RA的基因治疗中, 以反转录病毒作为载体已取得很好的治疗效果。用编码MT1MMP反义RNA的重组反转录病毒转染RA患者的滑膜成纤维细胞60 d后进行定量PCR、 Western blot和免疫组化染色检测得MT1MMP反义mRNA是对照组的15倍, 其蛋白的水平大大降低, 关节软骨的损伤和炎症也有很大的减轻[1]。用构建的能分解成纤维细胞中组织蛋白酶L(cathepsin L, CL)mRNA的核酶RzCL533和RzCL790的重组反转录病毒载体转染RA患者的成纤维样滑膜细胞[2], 与对照组相比较CL mRNA分别降低到44%和20%, CL蛋白的水平从16.0 μg/L分别降到4.1和8.2 μg/L, 并明显地减少了软骨的破坏, 关节的炎症反应受到很大抑制。其不足的是, 逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞, 其与受染细胞的整合具有随机性, 有潜在的危险性, 因此, 若要将其安全应用于人体, 还需进一步改造。 毕业论文 　　1.2; 慢病毒（Ientivirus）载体; 慢病毒是一类免疫缺陷性病毒, 由于其可引起慢性转染而得名, 属于逆转录病毒家族的成员。慢病毒载体与逆转录病毒载体的主要区别在于, ; 前者既能转染分裂的细胞, 也能转染非分裂的细胞, 可用于神经细胞、 巨噬细胞、 造血干细胞、 肌肉细胞和肝细胞等[3]。但慢病毒不能转染G0 期细胞, 这是由于在G0 期细胞中慢病毒不能进行逆转录过程[4]。将能表达鼠血管他丁（angiostatin）的人类免疫缺陷病毒载体（HIVvector）注入RA鼠的右侧膝关节[5], 与对照组相比较该鼠此关节滑膜细胞的增生和血管翳的形成明显被抑制。经过改造的含有TNFα基因的有蹄类猫免疫缺陷病毒(FIV)载体也能高效转染SCID鼠膝关节原代滑膜细胞[6]。免疫缺陷病毒载体是基因治疗的一种有效载体, 但仍存在不少问题: 如需要获得产生高滴度和连续的载体细胞系, 制备重构高转化率和高整合率的载体等。 毕业论文 　　1.3; 腺病毒载体; 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒, 其基因组长约36 kb, 含有早期转录区（E1、 E2、 E3、 E4）和晚期转录区（L1、 L2、 L3、 L4、 L5）。E1基因位于基因组的1.0～1.6基因图距单位（Mu）, 为病毒复制的必须区, 缺失E1基因的腺病毒为复制缺陷的腺病毒载体。E3区位于基因组78～86 Mu, 是病毒复制的非必须区, 可作为外源基因的插入区。腺病毒载体通常缺失E1和E3区域。作为基因治疗的载体, 腺病毒载体具有以下显著优点: （1）基因组大, 可插入大片段的外源基因（至多可达35 kb）; （2）可高效地转染不同