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维生素K2 对K562细胞生长抑制作用实验探究 　 作者：邵泽叶 ，陈宝安 ，夏国华，丁家华，朱怀刚 【摘要］目的: 研究维生素K2 （VK 2 ）对慢性粒细胞白血病急性变细胞株K562细胞的生长抑制作用及其机制。 方法: 采用形态学检测VK2 作用后的细胞形态改变，MTT方法检测VK2 对K562细胞的生长抑制作用，流式细胞仪Annexin-V FITC .PI分析细胞凋亡，PI染色分析细胞周期变化，RT.PCR技术检测抗凋亡基因bcl.2、促凋亡基因bax的表达。 结果: 经VK2 作用后细胞出现明显的形态学改变:细胞变小，核固缩，核染色质聚集边挤于核膜内侧呈新月形以及典型凋亡小体形成等;MTT结果显示VK 2 对K562细胞有明显的抑制作用，作用72h半数抑制浓度为25.1μmol#12539;L-1 ;流式细胞仪检测结果显示随着VK 2 浓度的增加凋亡率逐渐增高（Plt;0.05），随着作用时间的延长凋亡率也逐渐增高（Plt;0.05）;VK 2 作用72h，S期细胞逐渐减少（r=-0.99，Plt;0.05），G 0 .G 1 期细胞逐渐增加（r=1.00），细胞被阻滞在G 0 .G 1 期;随着VK 2 浓度的增高抗凋亡基因bcl.2表达明显下调，而促凋亡基因bax表达无明显差异。 结论: VK 2 通过诱导K562细胞凋亡抑制其增殖，并呈浓度和时间依赖性;抗凋亡基因bcl.2下调可能是VK 2 诱导K562细胞发生凋亡的机制之一。 ［关键词］ 维生素K 2 ;K562细胞;细胞凋亡;细胞周期;基因表达;抗凋亡基因bcl.2 维生素K2 （VK2 ）是天然的具有萘醌核结构的化合物，有凝血活性，临床上作为止血药物已应用多年。近几年有关VK2 抗肿瘤的作用1～7］ 日益受到重视，但对作用机制研究甚少。本实验研究了VK 2 对K562细胞的生长增殖、诱导凋亡作用及其机制。 1 材料与方法 1.1 材料与细胞培养 VK2 购自Sigma公司，用无水乙醇配成浓度为5、10、20和40μmol#12539;L-1 ，实验表明该浓度乙醇对K562细胞生长无影响。K562细胞株购自上海细胞生物研究所，用RPMI.1640培养液加10%小牛血清，在37℃饱和湿度条件下体积分数为0.05的CO 2 培养箱中培养。 1.2 MTT比色法取对数生长期细胞，调细胞浓度为1×10 5 ml-1 接种于96孔培养板，实验组分成4组分别加入不同浓度（5、10、20和40μmol#12539;L-1 ）VK2 ，对照组不加药，另设空白对照组（只加培养液）。置37℃、体积分数为0.05的CO2 饱和湿度培养箱中孵育，分别于24、48、72和96h取出加MTT（终浓度为0.5mg#12539;ml-1 ）20μl，继续培养4h，弃上清，加二甲亚砜150μl，摇床震荡10min，用酶标仪（B-L）570nm波长读取光密度，以时间为横坐标、A值为纵坐标绘制细胞生长曲线，半数抑制浓度（IC 50 ）采用Logit法计算。实验重复3次，每孔设复孔5个，取均值为最终结果。 1.3 细胞形态学观察取对数生长期细胞，调细胞浓度为1×10 5 ml -1 ，试验组加入不同浓度VK2 ，对照组不加药培养72h，收集细胞涂片作瑞氏染色观察细胞形态的改变。 取对数生长期细胞调细胞浓度为1×10 5 ml-1 ，接种于6孔培养板，分别加入不同浓度（0、5、10、20和40μmol#12539;ml -1 ）的VK 2 ，分别于孵育24、48、72和96h收集细胞，经PBS洗涤后加Annexin-V FITC 和PI避光作用10min后在流式细胞仪上检测凋亡细胞。结果Annexin- Ⅴ染色阳性PI染色阴性和Annexin-Ⅴ染色阳性PI染 色阳性细胞均为凋亡细胞，而Annexin-Ⅴ染色阴性PI染色阳性为机械损伤细胞。 1.4 细胞周期分析 于Annexin-Ⅴ.PI检测细胞凋亡的同时收集1×10 6 细胞进行细胞周期分析，所有资料经Multieycle1.0DNA分析软件分析。 1.5 RT.PCR半定量检测bcl.2和baxmRNA表达引物由上海生工生物工程公司合成:bax（258bp）:5′.ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC.3′，R:5′.TGTC-CAGCCGCATGATGGTTC.3′;bcl.2（326bp）F:5′.GACT-TCGCCGAGATGTCCA.3′，R:5′.GTCTTGAGAGA-CAGCCAGGA.3′;GAPDH（内对照）F:5′.TCCCATCAC-CATCTTCCA.3′，R:5′.CATCACGCCACAGTTTCC.3′。总RNA抽提:按Promema公司提供的试剂盒建议的步骤操作。逆转录:在0.5