维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化为树突状细胞实验探究.doc

维甲酸联合卡介苗诱导HL-60细胞分化为树突状细胞实验探究 　【摘要】目的 HL-60细胞用经典方法不容易培养成树突状细胞（DC）,需探索一种有效获取HL-60细胞源性DC的方法,为APL复发及MDR的免疫治疗提供新的策略。方法 HL-60细胞株在完全培养基中培养,以GM-CSF、IL-4、TNF-α等共处理, 只在实验组加用卡介苗和ATRA。观测细胞形态，检测DC免疫表型、上清夜IL-12水平测定，观察MLR反应。结果 使用卡介苗和ATRA后获得了具有较明显树突状突起的细胞，DC表型CD83为(29.46±2.67)%、CD80为（65.23±4.65)%、CD86为(56±3.76)%、HLA-DR为(27.87±3.64)%及CD1d为(30.11±3.92)%,均明显升高(plt;0.05),上清液IL-12水平为(182.44±11.96 pg/ml),亦明显升高(plt;0.05)，并具有明显的MLR反应。结论 利用ATRA联合卡介苗可以成功地诱导HL-60细胞为成熟DC，其CD1d表达明显增高，推测可能参与NKT细胞激活,具体机制需进一步研究。 【关键词】全反式维甲酸 卡介苗 HL-60细胞 树突状细胞 树突状细胞（Dendritic cell,DC）是体内功能最强大的抗原递呈细胞(APCs),其能启动自身特异性杀瘤免疫反应,但DC在人体内所占数量极微。目前 以末梢血中的单核细胞或CD34+细胞,可以诱导培养出大量DCs。国内外有大量实验证明白血病细胞用经典的方法能被诱导成DC。但用经典的方法培养，HL-60细胞很难培养成树突状细胞。 19世纪80年代开始了用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗APL，取得巨大成功。Huang S等报道，JWA（AF070523）作为ATRA的一种靶基因，ATRA作用下使JWA下调，促进NB4、K562、HL－60向粒或单核细胞方向分化。我们实验室已成功地用ATRA诱导分化作用 诱导APL细胞为DC。本实验应用ATRA和卡介苗，观察HL-60细胞能否分化为有功能的DC，为L-DC疫苗提供新的策略。 1 材料和方法 1.1 细胞和主要试剂 IL-12 ELISA为试剂盒为晶美生物公司产品,rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α为Bioscience公司产品,抗人CD1a-PE、CD1d-PE、 CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC单抗为Burlingame公司产品，ATRA为山东良福集团制药有限公司产品，卡介苗（ BCGV）上海生物制品研究所。 1.2 细胞培养 HL-60细胞在含体积分数为10%的小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中贴壁培养，隔日换液，根据细胞增殖密度进行传代。 1.3 实验分组 调整细胞浓度为1×106/ml,分别接种于24孔培养板（1ml/孔）。ATRA溶解于无水乙醇。实验组依需加入ATRA（终浓度为1×10-6 mol/L）、rhGM-CSF（终浓度为1000U/ml）、rhIL-4（终浓度为500U/ml）、卡介苗（终浓度为3×104cfu），在培养第8天时,加入100ng/ml的TNF-a,继续培养72小时。对照组使用rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-a和无水乙醇作为对照。空白对照组仅使用rhGM-CSF及rhIL-4及TNF-a。 1.4 DC的形态及表型检测 倒置显微镜动态观察细胞并摄片，将培育DC浓度调节为1×106/ml，取细胞悬液100μl/管，分别加入CD1a-PE、CD1d-PE 、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE及HLA-DR-FITC单抗各15μl，混匀反应30min，流式细胞仪进行分析。 1.5 IL-12测定 上清液IL-12水平测定，具体操作按ELISA 试剂盒说明书进行。 1.6 CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR） L-DCs用丝裂霉素(25μg／L)处理1 h去增殖后作为刺激细胞，刺激健康自愿者外周血T细胞(DC：T细胞分别为1：100，1：50，1：10，1：1)与2×105个／ml的T细胞在96孔圆底培养板中作用5天。总体积为每孔200μl，对每个浓度均作3个平行孔，每孔加入CCK8（20 μl/孔）在37℃饱和湿度、5%CO2孵箱中培养4 h，用酶标仪检测波长450 nm时的吸光度(A)值，参比波长为630 nm，结果取均值。算刺激指数(SI)。SI=实验孔的A值／对照孔的A值。 1.7 统计学分析 采用SPSS16.0软件，所测数据用均数±标准差（x-±s）表示，采用one-way analysis of vari