绿茶提取物及表没食子儿茶素没食子酸酯对免疫细胞作用探究.docVIP

绿茶提取物及表没食子儿茶素没食子酸酯对免疫细胞作用探究 　 作者：张凤，杨桂文，张福淼，赵静，崔英杰，安利国 【摘要】 　　目的研究绿茶提取物和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对脾脏细胞增殖和巨噬细胞NO分泌的影响。方法采用MTT法检测脾脏细胞增殖变化，用Griess试剂法检测NO产量的变化。结果绿茶提取物和EGCG都能够促进脾脏细胞增殖，并能够协同conA刺激脾脏细胞的增殖；还能够抑制LPS激活的巨噬细胞RAW264.7的NO产量。结论绿茶提取物和EGCG具有免疫调节和减轻炎症反应的有益作用。 【关键词】 绿茶 表没食子儿茶素没食子酸酯 免疫细胞 　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of green tea extract and Epigallocatechin gallate（EGCG） on spleen cell proliferation and macrophage NO production.MethodsMTT assay was used to detect spleen cell proliferation change and Griess reagent method was used to detect macrophage NO secretion. ResultsGreen tea extract and EGCG could promote spleen cell proliferation and be able to cooperate with conA to stimulate spleen cell proliferation.They could also inhibit LPS-activated macrophages RAW264.7 NO production.ConclusionGreen tea extract and EGCG have immunoregulative effect and can alleviate inflammatory reaction. 　　Key words：Green tea; EGCG; Immune cells 　　现代研究表明绿茶具有抗氧化、抗癌和防癌、降血糖、抑菌和抗病毒等生物学活性［1～5］。在人们日益注重保健养生的今天，绿茶的系列生物学活性无疑也成为研究的热点。本实验选用山东日照绿茶为材料，用70％乙醇法抽提得到绿茶提取物，研究其对免疫细胞的作用。 　　1 器材 　　昆明种小鼠（山东大学实验动物中心）。EGCG （Sigma）；绿茶提取物（70％乙醇法抽提）；RPMI 1640干粉（GIBCO）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；噻唑蓝（Sigma）； 青霉素、链霉素（北京鼎国生物技术发展中心）；ConA（Sigma）；LPS（Sigma）；DMR 显微镜（Leica）；MCO-17AC二氧化碳培养箱（SANYO；Model 550 酶标仪（BIO-RAD）。 　　红细胞裂解液：NH4 Cl 8.29 g，KHCO3 1 g，EDTANa 37.2 mg。将以上试剂溶解于800 ml三蒸水，充分搅拌溶解混匀后，用1N的盐酸调pH值至7.2～7.4，加水补足到1 000 ml。过滤除菌，4℃保存备用。 　　Griess试剂：A液：对氨基苯磺酰胺0.5 g，10％醋酸150 ml；B液：α－萘胺0.1 g，三蒸水20 ml，10％醋酸150 ml，冰箱中保存，使用前A液B液等体积混合。 　　2 方法 　　2.1 MTT法测定小鼠脾脏细胞的增殖取实验小鼠，脱颈处死。无菌条件下取出脾脏，剪碎，200目尼龙网过滤。收集的细胞以无血清RPMI1640培养液洗涤两遍，收集后加红细胞裂解液，中止裂解后收集细胞，以无血清RPMI1640培养液洗涤两遍，重悬细胞于RPMI1640培养液中。调整脾脏细胞浓度为（2×106 cells / ml），置于96孔板中，绿茶提取物或EGCG作用48 h及绿茶提取物或EGCG与ConA（20 μg/ml）共作用48 h。实验终止前4 h每孔加MTT (5 mg/ml) 20 μl，离心，弃上清液中止反应，每孔加150 μl 二甲基亚砜，轻轻摇动30 min溶解紫色结晶，490 nm波长酶标仪比色。 　　SI=ConA刺激后A值/未加刺激A值 　　2.2 Griess’ S法测定巨噬细胞RAW264.7 NO产量NO的定量可通过测定NO2-和NO3-的总和来实现，根据这一原理，应用Griess S 试剂来定量检测NO水平。巨噬细胞培养上清与GriessS 试剂室温下反应10 min，于490 nm处检测吸光值。 　　3 结果