羟基喜树碱对人胰腺癌细胞PANC-1生长抑制作用.doc

羟基喜树碱对人胰腺癌细胞PANC-1生长抑制作用 　 作者：赖日勇，李小波，许春鹃，叶金花 【摘要】 　　目的研究羟基喜树碱对人胰腺癌PANC-1细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法MTT法测定羟基喜树碱对PANC-1细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测羟基喜树碱对PANC-1细胞周期、凋亡率和Caspase-3活性的影响。结果羟基喜树碱能抑制PANC-1细胞生长，并呈剂量依赖关系，其半数抑制浓度(IC50)为51.52 μg/ml；流式细胞仪检测显示低浓度羟基喜树碱处理后可将细胞先后阻滞于S 期和G2/M 期，高浓度的羟基喜树碱则诱导细胞凋亡；细胞凋亡率和Caspase-3活性随药物浓度升高和处理时间延长而逐渐递增。结论羟基喜树碱能抑制人胰腺癌PANC-1细胞的生长，其抗肿瘤作用机制与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡和激活Caspase-3活性有关。 【关键词】 羟基喜树碱 人胰腺癌细胞PANC-1 抗肿瘤作用 羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin, HCPT）是从我国珙桐科植物喜树中分离出的20多个单体中抗癌作用最强的微量植物碱，是一种DNA拓扑异构酶I（DNA topoisomerase I, DNA TopoI）抑制剂。大量的临床研究证明，羟基喜树碱具有抗肿瘤作用强和毒性低的优点，具有广谱抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率［1］。目前羟基喜树碱对胰腺癌的治疗研究很少［2］，为此本文研究了羟基喜树碱对胰腺癌细胞PANC-1的抑制作用及其作用机制，以期为临床应用提供理论基础和依据。 　　1 材料与仪器 　　1.1 细胞系人胰腺癌细胞PANC-1由日本大阪大学消化器一般外科赠送。 　　1.2 药品与仪器羟基喜树碱针剂（贵州汉方制药有限公司提供，批；噻唑蓝（MTT）、DMEM高糖培养基（GIBCO公司产品）；二甲基亚砜(DMSO，上海生物工程有限公司产品) ；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；细胞周期测定试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒、流式细胞仪（Bection Dikinson公司产品）； CO2培养箱（Forma公司产品）；Multiskan MK3酶标仪(Thermo Labsystems公司产品)。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养将PANC-1细胞接种于含10％灭活新生牛血清的DMEM高糖培养液中（不含抗生素），在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养。3 d传代1次，隔天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用各种浓度的羟基喜树碱处理细胞，未加药组为对照组。 　　2.2 细胞生长抑制率的测定采用噻唑蓝还原法进行检测。取对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔培养板中(密度为1×104/孔)，每组设6个平行孔。加入用DMEM高糖培养液稀释的不同浓度羟基喜树碱(6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/ml)分别培养，以未加羟基喜树碱为对照组。加药培养48 h后每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37 ℃继续培养4 h后，离心后吸去上清液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min使结晶充分溶解,酶标仪570 nm 波长检测各孔吸光度(A值),计算细胞生长抑制率及半数抑制浓度（IC50）值。细胞生长抑制率（%）=(1-实验组平均A值/对照组平均A值) ×100%。 　　2.3 细胞周期及凋亡率测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100μg/ml)处理24、48和72 h后的PANC-1细胞，预冷的PBS洗涤细胞两次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的PBS，细胞经溴化丙啶(PI，10 μg/ml)染色5 min，4℃避光30 min后，上流式细胞仪，激发光波长为488 nm，吸收波长610 nm。检测细胞DNA水平，根据DNA水平在流式细胞仪中得出每份样品的G0/G1，S和G2/M期细胞分布图。LY-SIS软件(Becton Dickinson公司产品)分析。 　　2.4 细胞Caspase-3活性（相对荧光值）测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100 μg/ml)处理24，48和72 h后的PANC-1细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的PBS，按Caspase-3活性测定试剂盒说明书进行操作,上流式细胞仪测定Caspase-3活性（相对荧光值）。 　　2.5 统计学分析采用统计软件SPSS 14.0进行数据处理。 　　3 结果 　　3.1 羟基喜树碱对PANC-1细胞生长抑制率的测定结果见图1。羟基喜树碱能有效抑制PANC-1细胞生长，6