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肠道致病菌多重PCR快速检测体系探究 　沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌，严重的危害着人类健康和牲畜的安全〔1〕。因此，建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点。PCR技术提供了理想的检测方法。本实验采用多重PCR方法，可在同一反应体系中检测不同的细菌，整个过程只需要2～3h，应用前景广阔。　　1 材料与方法 　　11 实验菌株 肠炎沙门菌、阿柏丁沙门菌，鸡雏沙门菌，德尔比沙门菌、鼠伤寒沙菌，福氏志贺2a，福氏志贺2b，宋氏志贺菌，枸缘酸杆菌，变形杆菌，河弧菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌(四川省疾病预防控制中心)；产毒素大肠埃希菌C83921，产毒素大肠埃希菌C83902（中国兽医药品监察所）；侵袭性大肠埃希菌（中国生物制品研究所）。 　　12 试剂 染料、缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、核酸染料(GV)、琼脂糖、Marker等(北京塞百盛基因技术公司)。 　　13 主要设备 PCR基因扩增仪、台式高速离心机、紫外可见凝胶成像系统、核酸分析仪、微量加样枪(德国Eppendorf公司)；电泳槽、DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)。 　　14 方法 　　141 引物设计 沙门菌组氨酸转运操纵子基因片段具有沙门菌属特异性〔2-4〕，根据Genebank V01373提供的基因序列设计引物，即引物1:5′-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3′；引物2:5′-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3′由于ipaH基因存在于所有志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的质粒和染色体上〔5〕，根据Genebank M32063提供的序列设计志贺菌和EIEC引物,引物序列为:引物1：5′- TGT ATC ACA GAT ATG GCA TGC -3′；引物2：5′- TCC GGA GAT TGT TCC ATG TG -3′。选择不耐热肠毒素(LT)的编码基因保守区〔6〕，根据Genebank S60731提供的序列设计一对引物为：引物1：5′-GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G-3′引物2：5′-AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C-3′。 　　142 DNA模板的提取 采用热裂解法，取细菌培养液10ml,置于Eppendorf管中,8000r／min，灭菌蒸馏水洗涤2次,最后用1ml蒸馏水悬浮,隔水煮沸10min,8000r／min，离心10min,取上清,即为DNA模板溶液。 　　143 多重PCR扩增条件的优化 通过多次试验先确定了变化较小的因素buffer,dNTP,再对影响较大的因素如MgCl2浓度、引物浓度、Taq酶用量、模板浓度，在1个范围内做正交实验，再进行局部微调，最后调整退火温度和循环数参数等。取PCR产物5μl及DNA Marker参照物在含有(GV)的1%琼脂糖凝胶中电泳，电压75V,电泳40min后在紫外灯下观察结果。 　　144 多重PCR体系的特异性、灵敏度、样品检测 (1)特异性检测：9株标准目的菌株和7株非目的菌株,提取DNA模板,然后进行PCR扩增，电泳后观察有无条带的出现。(2)灵敏度检测：将从目的菌株提取的DNA模板用核酸分析仪测定DNA含量,然后作10倍梯度稀释,取每个稀释度的DNA进行PCR扩增,电泳后观察条带的亮度,直到不出现扩增带为止。(3)样品的检测：从牛肉中分离的可疑菌株,提取DNA模板,进行多重PCR扩增。同时,按常规进行生化检验和玻板凝集试验。 　　145 PCR试剂盒组成 经反复试验,组装多重PCR试剂盒。包括PCR反应管,PCR反应液［染料，缓冲溶液（Mg2+），dNTP，引物］,琼脂糖粉,GoldView染料，Taq酶,阳性对照,阴性对照,液体石蜡。 　　2 结果 　　21 PCR反应条件的优化 反应体积50μl,10×buffer 5μl，引物各025μl（50μmol/L）,Taq聚合酶08μl(5U/μl),dNTPs 2μl（10mmol/L）,粗提DNA模板各1μl。扩增条件:94℃预变性4min,94℃变性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32个循环，最后72℃保温5min，见图1。 　　1：肠炎沙门菌；2：阿柏丁沙门菌；3：鸡雏沙门菌；4：德尔比沙门菌；5：鼠伤寒沙门菌；6：产毒素大肠埃希菌C83902；7：产毒素大肠埃希菌C83902；8：福氏志贺2a；9：福氏志贺2b；1