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肠道菌群失调对免疫细胞及细胞因子影响 　 作者：张亚超 王沛　张玉玲　孙晓丽　刘颖　王仁杰 【摘要】 目的探讨菌群失调对机体免疫细胞和细胞因子的影响。方法用卡那霉素制作小鼠肠道菌群失调的动物摸型，进行肠道菌群的定量分析，同时进行免疫细胞和细胞因子相关指标的测定。结果实验组小鼠肠道内菌群数量明显低于对照组（Plt;0.01）。菌群失调后实验组小鼠较对照组脾细胞数、脾抗体形成细胞数减少，脾重量减轻（Plt;0.05或Plt;0.01）；实验组小鼠血清白细胞介素-2（IL2）和粒巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）的含量较对照组低（Plt;0.01）。结论肠道菌群失调可减少机体的免疫细胞及降低细胞因子。 【关键词】 小鼠；菌群失调；免疫细胞；细胞因子 人和动物体内存在大量有益菌，这些菌不但对机体无毒、无害，而且参与宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染的过程。大量研究证明，它在维持机体健康的微生态平衡中起着重要的作用。我们应用抗生素脱污染使小鼠肠道菌群失调，然后观察对机体免疫细胞及细胞因子的影响。 1 材料和方法 1.1 实验动物 纯系BALB/C小鼠80只，8周龄，体重18～22 g，雌雄各半，由河北医科大学实验动物学部提供。 1.2 实验材料 卡那霉素由中国药品生物制品鉴定所提供; 非选择性培养基和选择性培养基EMB、EC、BS、LBS（分别培养肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌）均由天津金章医用新技术研究所提供；豚鼠补体由本实验室制备。 1.3 实验方法 1.3.1 动物模型制备［1］ 将实验动物随机抽取实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠卡那霉素50 mg（稀释量为0.4 ml）灌胃，每天上午1次，连续10 d；对照组小鼠蒸馏水0.4 ml灌胃，方法及天数同实验组。所有小鼠10 d后采取摘眼球放眶血方法处死，盲肠内容物用于肠道菌群的培养，验证动物模型是否准确建立。 1.3.2 小鼠肠道菌群和脾重量的检测 实验组和对照组小鼠各10只,按上述方法制作动物模型,然后放眶血处死。取盲肠内容物0.1 g，置于放有玻璃球的小瓶中，加入0.9 ml无菌生理盐水，加盖，200 r/min在振荡器上振荡15 min，均质化的标本稀释度为10-1，从此混合液中吸取0.2 ml，再加1.8 ml无菌生理盐水，混匀，此标本稀释度为10-2，继续进行10倍稀释至10-8。采用Mile与Misra所介绍的方法接种，每个稀释度定量接种3个液滴。选择适当的计算菌落的稀释度进行菌落计算。结果以Log的菌落形成单位/克(CFU/g)表示。小鼠处死后用75％酒精浸泡2 min，取出后固定在蜡盘上，解剖腹腔，将脾脏与周围组织分离取出，用滤纸吸除黏附的血液后，称重。 1.3.3 脾抗体形成细胞(PFC)测定 实验组和对照组各10只小鼠，每日每只50 mg卡那霉素灌服。服药3 d后，同时用绵羊红细胞（SRBC）免疫，5% SRBC腹腔注射0.4 ml，连续免疫4 d，再喂药7 d后，断颈处死小鼠，取出脾脏。将小鼠脾脏用100目钢网和注射器芯研磨制成单个脾细胞悬液，用Hank液洗两遍，1 000 r/min，离心15 min，每个脾细胞加6 ml Hank液混匀。取24孔板，每孔加180 μl Hank液，50 μl 1∶3稀释的豚鼠补体，50 μl　10％SRBC，20 μl脾细胞，混匀，填充小室，蜡封小室边缘，37℃ 1.5 h温箱孵育，计数小室内空斑数量。 1.3.4 白细胞介素(IL)2和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)测定 实验组和对照组各10只小鼠,模型建立和免疫同上,小鼠摘眼球处死，取眼眶静脉血于试管中，静置1 h后，离心，取血清。采用双抗体夹心ELISA法分别按照试剂盒说明进行检测。待测血清中的IL2、GMCSF与包被抗小鼠IL2、GMCSF单抗体结合，加入酶标抗体后形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应，429 nm处测OD值，IL2、GMCSF浓度与OD值成正比。检测程序：①建立标准曲线；②加样：待测品孔每孔各加入待测样品100 μl；③将反应板充分混匀后置37℃,120 min；④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，滤纸上印干；⑤每孔中加入第一抗体液50 μl，将反应板置37℃,60 min，洗板同前；⑥每孔加酶标抗体工作液100 μl，将反应板置37℃,60 min，洗板同前；⑦每孔加底物工作液100 μl，置37℃暗处反应5～10 min，每孔加入1滴终止液混匀；⑧在429 nm处测吸光度值；⑨在半对数纸上画出标准曲线，根据样品的A值在曲线上查出相应的IL2、GMCSF含量。 　 2 结果 2.1 肠道正常菌群 见表1。 表1肠道正常菌群的测定结果 2.2脾脏相关指标见