肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞MMP3，MMP9及TIMP-2表.docVIP

肿瘤坏死因子-α对体外培养牛眼小梁细胞MMP3，MMP9及TIMP-2表 　 作者：吴琼，张德秀，李琛，齐翔云 【摘要】 目的：观察肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3，MMP9和TIMP-2表达的影响，探讨原发性开角型青光眼的发病机制。方法：对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养，应用免疫组化方法（NSE，Ⅷ因子相关抗原染色）鉴定细胞，化学及电子透射电镜对细胞进行形态学及生长特性的观察；对传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0，12.5，25，50μg/L的培养液，48h后行MMP3和MMP9免疫组化SP染色，结果进行计算机图像分析并进行统计学检验。分组提取细胞培养液用ELASA检测TIMP-2量的变化。结果：体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9，TNF-α可增加MMP3及MMP9的表达，并且抑制TIMP-2的表达。 结论：TNF-α在一定范围内可以增加MMP3及MMP9的表达（P＜0.05），并抑制TIMP-2的表达（P＜0.01），故TNF-α可以减少小梁细胞细胞外基质的堆积，使房水引流通畅，对激光小梁成形术的手术原理有一定的说明意义。 【关键词】 牛眼小梁细胞 0 引言 细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的异常堆积是原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG）小梁网组织的重要改变。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一族降解ECM成分的含锌蛋白酶类，对于维持ECM不断产生与降解的动态平衡及正常的房水引流阻力具有重要意义。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一类重要的炎症因子，在激光小梁成形术后，眼内形成无菌性炎症生成TNF-α，而推测TNF-α就是通过调节MMP及其组织抑制物（tissue inhibitor,TIMP）的表达从而影响房水流出阻力。 1材料和方法 1.1材料 取附近屠宰场现杀新鲜牛眼，牛眼符合下列条件：①全部为小牛眼：牛龄小于24mo，以保证TMC培养的成活率；②剜取牛眼时如有眼球破裂及眼内炎症则全部废弃，以减少污染机会。将牛眼置于盛有冰袋的保温桶中迅速运回实验室。DMEM高糖培养基购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，EDTA购自Sigma公司，谷氨酰胺购自Sigma 公司。神经元特异性烯醇化酶（neuronal specific enolase，NSE）mAb、第Ⅷ因子相关抗原（factor Ⅷ related antigen，ⅧR:Ag）mAb、波形蛋白（vimentin）mAb均由西安交通大学第二医院病理科提供。MMP3，MMP9及TIMP-2mAb购自博士德试剂公司。SP免疫组化试剂盒购自华美试剂公司。ELASA试剂盒购自上海轩昊试剂公司，标准品和质控品均采用试剂盒中配套产品。试剂盒包括：酶标板1块，标准品1管，样品稀释液1瓶，浓缩洗涤液1瓶，抗TIMP-2抗体1瓶，HRP1瓶，TMB显色液和终止液各1瓶。 1.2方法 牛眼小梁细胞培养参考杨新光等[1,2]的方法。小梁细胞游离出组织块后，每周换液2次。待细胞长满瓶底后用1.25g/L的胰蛋白酶和0.2g/L EDTA消化传代。取传2代的小梁细胞接种于预置盖玻片的培养皿，待细胞贴壁2d后用0.01mol/L PBS 清洗3次，40g/L的多聚甲醛固定，行NSE、vimentin及ⅧR：Ag免疫组化染色。另取细胞铺片，用4℃预冷的20g/L戊二醛固定，送电镜室常规透射电镜标本制备。 1.2.1 MMP3和MMP9含量测定 取传3代的小梁细胞经消化离心后以5×107个/L的密度接种于预置盖玻片的6孔板中（每孔预置4张盖玻片），待细胞贴壁、基本长满盖玻片后，更换无血清培养基饥饿24h，24h后分别向各孔中施加TNF-α，使其终浓度分别为0（对照组）,12.5，25，50μg/L，24h后吸出细胞培养液,取出细胞爬片，0.01mol/L PBS冲洗3次,每次3min，用4g/L多聚甲醛固定，每一浓度组制备16张标本。对细胞爬片进行MMP3及MMP9 免疫组化SP法染色，染色结果在显微镜下观察并摄影。 1.2.2 TIMP-2含量测定 另取传3代的小梁细胞经消化离心后以5×107个/L的密度接种于24孔板和12孔板中，待细胞贴壁、基本长满孔底时，换用无血清培养基饥饿24h, 24h后分别加入TNF-α，使其在每孔中的终浓度分别为0（对照组），12.5，25，50μg/L，其中24孔板中每个浓度组6孔，12孔板中每个浓度组2孔。分别于12，24，36，48h时吸出24孔板中各浓度组细胞的培养上清，分装于EP管中，-20℃保存。1