肿瘤坏死因子β基因多态性及西方型、 亚洲型多发性硬化相关性.docVIP

肿瘤坏死因子β基因多态性及西方型、 亚洲型多发性硬化相关性 　 作者：宋秀娟, 郭力, 侯慧清, 杨静, 刘静 【摘要】 　　目的: 研究肿瘤坏死因子β（TNFβ）基因多态性与西方型、 亚洲型多发性硬化（MS）的相关性。方法: 采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术对22例西方型MS患者、 36例亚洲型MS患者和79名健康人进行TNFβ基因多态性分析。对两型MS组患者分别进行神经功能缺损程度的扩展病残状态(EDSS)评分、 首发年龄、 病程、 发病次数等临床资料收集。结果: ①亚洲型MS组TNFβ1等位基因频率为51.39%, 较健康人（27.85%）明显升高（Plt;0.01)。②西方型MS组与亚洲型MS组基因型为TNFβ1/1、 TNFβ1/2、 TNFβ2/2 的EDSS评分组间比较差异均无统计学意义（Pgt;0.05)。③两亚型在EDSS评分、 首发年龄、 性别、 病程、 发病次数诸方面均无统计学意义。结论: TNFβ1等位基因与亚洲型MS的易患性有关。TNFβ基因多态性与EDSS评分无明显相关性。 【关键词】 肿瘤坏死因子β 多发性硬化 多态性 等位基因 EDSS 　　多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病。肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor beta, TNFβ）是一种参与免疫应答的细胞因子, 研究发现TNFβ具有基因多态性[1]。由于TNFβ的重要免疫学作用, 有必要从分子水平进一步探讨西方型和亚洲型MS的免疫遗传机制。我们采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术, 探讨了TNFβ基因多态性在两型MS患者中的分布, 并将基因多态性与两型MS的扩展病残状态（an expanded disability status scale, EDSS）评分以及两型MS临床资料之间的差异进行了相关性研究。 　　1 对象和方法 　　1.1 研究对象 MS患者58例系2003～2006年我院住院患者, 均符合临床确诊及实验室检查支持确诊的MS诊断标准, 依据Kira等[2]的方法将MS分为西方型和亚洲型两型。西方型组22（男9, 女13）例, 年龄15～71岁, 平均32.1岁; 首次发病年龄11～63岁, 平均30.2岁; 病程6 d～108个月, 平均26.1个月; 发病次数1～8次, 平均2.4次。亚洲型组36（男12, 女24）例, 年龄17～63岁, 平均38.8岁; 首次发病年龄17～63岁, 平均36.7岁; 病程18 d～180个月, 平均32.6月; 发病次数1～6次, 平均2.3次。并对MS组患者分别进行神经功能缺损程度的EDSS评分[3]。正常对照组79（男27, 女52）例, 年龄14～69岁, 平均35.9岁。为本地健康献血员、 患者邻居或其家庭中与患者无血缘关系者。近期均无感染史, 经问诊和体检排除神经系统疾病和其他自身免疫性疾病, 年龄和性别均与病例组患者匹配。全部受试对象均取得知情同意。 　　1.2 方法 　　1.2.1 TNFβ基因多态性分析 以改良盐析法自抗凝血标本中抽提基因组DNA。采用PCR方法扩增TNFβ基因内含子区域包括+252位点的一段靶DNA, PCR体系总体积为50 μL, 上游引物为5′CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A3′, 下游引物为5′AGA GCT GCT GGG GAC ATG TCT G3′(引物序列为北京赛百盛公司合成), 参照Tarkowski等[4]的实验方法设计PCR扩增条件。扩增产物片段长度为782 bp。RFLP分析: 取10 μL PCR产物, 加入1单位Noc Ⅰ, 10×酶切缓冲液2 μL, 灭菌双蒸水补至总体积20 μL, 37℃温箱过夜。酶切产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶分析仪观察带型。实验中设阳性和阴性对照, 以确保PCR产物未被污染和限制性内切酶工作正常。基因分型实验在双盲状态下进行并对样本进行重复分型以控制随机分型错误。 　　1.2.2 EDSS评分 先根据锥体系统功能、 小脑功能、 脑干功能、 感觉功能、 直肠膀胱功能、 视觉功能、 大脑功能及其他功能共8项指标分别量化评分, 再综合得出神经功能缺损程度的EDSS总分。 　　1.2.3 统计学处理 TNFβ基因型、 等位基因、 性别用直接计数法, 并计算基因型及等位基因频率, 组间比较采用χ2检验。EDSS评分、 年龄、 病程及发病次数以x±s表示, 两组间比较用t检验, Plt;0.05为有统计学意义。所有分析均由SAS 6.12统计软